常用生物化學檢驗技術課件

常用生物化學檢驗技術課件1第1頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)光譜分析技術第二節(jié)電化學分析第三節(jié)電泳技術第四節(jié)層析技術第五節(jié)離心技術第六節(jié)自動生化分析技術

只講第一節(jié)，其它內(nèi)容在《臨床檢驗儀器學》中講授。

本章內(nèi)容概要2第2頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一教學目標和要求1、掌握分光光度技術的基本原理及定性和定量方法。2、熟悉分光光度計的的基本結構和操作方法光源檢查和波長校正、原子分光光度計的類型和影響熒光分析的因素3、了解其他光譜分析技術的基本原理及在生化檢驗中的應用。3第3頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)光譜分析技術分光光度技術的基本原理分光光度計的基本結構分光光度計的操作方法分光光度技術的定性和定量方法4第4頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一光譜分析技術原理：

利用各種化學物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結構或含量。光譜分析技術分類：發(fā)射光譜分析技術：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法

吸收光譜分析技術：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光度法和紅外光譜法

散射光譜分析技術：比濁法

5第5頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一一、分光光度技術的基本原理（一）吸光度與透光度

A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I

當光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設入射光強度為I0，透射光強度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T=I/I0T×100為T%稱為百分透光度。透光度的負對數(shù)稱為吸光度即：6第6頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一（二）Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎。其表達式為：A=KLC

式中A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度（Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）7第7頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一

據(jù)Lambert-Beer定律，當液層厚度為cm，濃度單位為mol/L時，吸光系數(shù)K稱為摩爾吸光系數(shù)(ε)。ε的意義是：當液層厚度為1cm，物質(zhì)濃度為1mol/L時在特定波長下的吸光度值。ε是物質(zhì)的特征性常數(shù)。8第8頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一（三）偏離Lambert-Beer定律的因素

應用Lambert-Beer定律產(chǎn)生誤差主要來源于光學和化學兩方面的因素。1．光學因素：

要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越大。

2．化學因素：

濃度、pH、溶劑和溫度等因素可影響化學平衡。

9第9頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一二、分光光度計的基本結構最常用的是可見分光光度計和紫外-可見光分光光度計

光源單色器比色杯檢測器顯示器五大部份結構：10第10頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一（一）光源光源定義：

指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強度和良好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強度不應隨波長有明顯的變化。光源種類：可見光分光光度計常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。

紫外光光度計常用氫燈作為光源。11第11頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一（二）單色器定義：

將來自光源的復合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。種類：濾光片棱鏡光柵12第12頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一（三）比色杯又稱為吸收池或比色皿材料：常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成

（五）顯示器（四）檢測器

檢測器是將透過溶液的光信號轉換為電信號，并將電信號放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。

是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。13第13頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一三、分光光度計的操作方法（一）分光光度計的基本操作以721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計的開關，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預熱。2.將波長旋至測定的波長。3.將空白液、校準液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關上比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。5.將開關置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.06.重復步驟4和57.將校準液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A）14第14頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一（二）吸光度的校正

鉻酸鉀的標準液可用于校正分光光度計的吸光度。在25℃，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的標準吸光度校正表進行比較，可檢測儀器吸光度的準確度。15第15頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一四、分光光度技術的定性和定量方法（一）分光光度技術的定性方法定性依據(jù)：最大吸收波長λmax和摩爾吸光系數(shù)ε2.摩爾消光系數(shù)ε方法1.最大吸收波長λmax方法16第16頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一（二）分光光度技術的定量方法1.標準曲線法

根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關系。配制一系列濃度的標準品溶液（濃度應包含高、中、低濃度范圍），按標本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標準液濃度為橫座標，以吸光度為縱座標，按最小二乘法的原理，將對應各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為標準曲線。待測溶液測定吸光度后，從標準曲線上可查出其相應的濃度。方法：17第17頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一制作和應用標準曲線時應注意下面幾點：（1）測定條件發(fā)生變化時（如更換標準品和試劑等），應重新繪制。（2）標準品應有高的純度，標準液的配制應準確。（3）當待測液吸光度超過線性范圍時，應將標本稀釋后再測定。（4）標本測定的條件應和標準曲線制作時的條件完全一致。18第18頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一2．比較法Cu=(Au×Cs)/As

己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標準管和標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標準品濃度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為：

其中Cu和Au為標本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標準管濃度和吸光度。用標準品法定量時，標準品的濃度應盡量和標本管濃度相近。19第19頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一3．其它分析方法

包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。20第20頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一五、其它光譜分析技術（一）火焰光