分子生物學(xué)中心法則

（優(yōu)選）分子生物學(xué)中心法則目前一頁\總數(shù)四十五頁\編于四點Reversetranscription中心法則及補(bǔ)充目前二頁\總數(shù)四十五頁\編于四點第19章DNA復(fù)制與修復(fù)（一）復(fù)制方式：半保留復(fù)制。物質(zhì)基礎(chǔ)：雙螺旋結(jié)構(gòu)目前三頁\總數(shù)四十五頁\編于四點氮標(biāo)記技術(shù)證實了DNA的半保留復(fù)制

以15NH4Cl為唯一氮源培養(yǎng)大腸桿菌，連續(xù)培養(yǎng)12代，使所有DNA標(biāo)記上15N；在普通培養(yǎng)基（14N)培養(yǎng)一代后，所有DNA密度介于14N～15N之間；培養(yǎng)兩代后，14N和14N～15N雜合分子等量出現(xiàn)。繼續(xù)培養(yǎng)，14N分子增多。目前四頁\總數(shù)四十五頁\編于四點(深藍(lán):15N)(粉紅:14N)DNA半保留復(fù)制的證據(jù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液含15N-DNA的細(xì)菌普通DNA重DNA第一代中等密度DNA第二代普通DNA中等密度DNA目前五頁\總數(shù)四十五頁\編于四點目前六頁\總數(shù)四十五頁\編于四點目前七頁\總數(shù)四十五頁\編于四點第二節(jié)原核生物DNA的復(fù)制DNA的復(fù)制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧三核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,簡寫為dNTP)聚合成DNA的過程。這是一個非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)，需要許多種酶和蛋白質(zhì)參與。目前八頁\總數(shù)四十五頁\編于四點一、DNA復(fù)制所需原料1）底物：dATP，dGTP，dCTP，dTTP， 總稱為dNTP2）DNA聚合酶，DNA-pol3）模板（template）：解開成單鏈的DNA母鏈4）引物（primer）：RNA引物5）其他酶和蛋白質(zhì)因子目前九頁\總數(shù)四十五頁\編于四點1、DNA聚合酶－復(fù)制的基本酶作用特點：從引物游離3’－OH開始加入脫氧核苷酸，需要底物，引物，模板，能量，Mg2+。DNA聚合酶為DNA指導(dǎo)的酶。目前十頁\總數(shù)四十五頁\編于四點原核細(xì)胞DNA聚合酶539DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

5’→3’聚合活性

+++聚合速度nt/s16~207250~1000對dNTP親和力

低低高5’→3’外切活性

+-+3’→5’外切活性

+++功能

修復(fù);去除引物；填補(bǔ)空缺

協(xié)助修復(fù)主要復(fù)制酶DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ：與突變存活有關(guān)的酶。目前十一頁\總數(shù)四十五頁\編于四點DNA-pol的5′3′聚合作用3’5’5’3’3’5’DNA-pol5’3’OHP目前十二頁\總數(shù)四十五頁\編于四點DNA-pol

I

5′3′外切活性切除引物，切除突變片段DNA-pol

I

3′5′外切活性：校讀（proofread）功能5’3’AG5’3’目前十三頁\總數(shù)四十五頁\編于四點小片段大片段（Klenowfragment）5‘→3’聚合功能，3'→5'外切酶活性5'→3'外切酶活性DNApolI的酶切片段EJPNMLHIORQGCDBFAK目前十四頁\總數(shù)四十五頁\編于四點引物酶(Primase)5′5′DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行。RNA引物5′3′5′3′目前十五頁\總數(shù)四十五頁\編于四點解除DNA高級結(jié)構(gòu)的酶與蛋白：DNA復(fù)制從起始點開始復(fù)制時，局部的DNA雙鏈必須打開，主要靠解螺旋酶（helicase)的作用，打開后的單鏈還需要單鏈結(jié)合蛋白與其結(jié)合，防止復(fù)性。在復(fù)制叉向前移動時造成前方DNA分子產(chǎn)生正超螺旋，必須由拓?fù)洚悩?gòu)酶來解決。目前十六頁\總數(shù)四十五頁\編于四點3、解螺旋酶(helicase)解螺旋酶作用：斷裂互補(bǔ)堿基間的氫鍵，使DNA成單鏈?；颍篸naA、B、C…蛋白：DnaA、B、C…ATP目前十七頁\總數(shù)四十五頁\編于四點4、拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase,Topo）一類能調(diào)節(jié)DNA分子超螺旋類型和水平的酶。DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋復(fù)制后形成負(fù)超螺旋復(fù)制前方形成正超螺旋DNA雙螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ酶Ⅱ，引入負(fù)超螺旋目前十八頁\總數(shù)四十五頁\編于四點消除復(fù)制叉前方形成的正超螺旋，即引入負(fù)超螺旋。切割DNA雙鏈，此時不需ATP；爾后由ATP供能，連接切口。不需ATP，切割雙鏈DNA中的一鏈，使DNA松弛后,連接切口。TopoⅠ:TopoⅡ:臨床上使用的某些抗腫瘤藥（如喜樹堿等）是通過抑制Topo酶活性而殺死腫瘤細(xì)胞的。作用方式：切割DNA鏈，使其松弛后再連接。目前十九頁\總數(shù)四十五頁\編于四點5、DNA連接酶－連接DNA片斷的酶連接酶(ligase)的作用是催化相鄰的DNA片段以3’、5’－磷酸二酯鍵相連接。連接反應(yīng)中的能量來自ATP(動物細(xì)胞或噬菌體）或NAD＋（細(xì)菌)。連接酶要求催化反應(yīng)時缺口處有一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的。不能將兩條游離的DNA分子連接起來。目前二十頁\總數(shù)四十五頁\編于四點連接酶的催化反應(yīng)目前二十一頁\總數(shù)四十五頁\編于四點二、DNA復(fù)制過程(544)各種生物DNA的復(fù)制過程大同小異，大致包括以下幾個階段。1、起始－有固定的起點（1）識別起始位點

復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(originalreplication)常用ori或o表示。多雙向、對稱等速復(fù)制。目前二十二頁\總數(shù)四十五頁\編于四點大腸桿菌的oriC大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點oriC由245bp組成，關(guān)鍵序列在于兩組短的重復(fù)：三個13bp和四個9bp組成的保守序列，是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置。目前二十三頁\總數(shù)四十五頁\編于四點（2）DNA解旋，形成復(fù)制叉解旋酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶與復(fù)制起點結(jié)合，解開雙螺旋成兩條局部的單鏈，SSB也隨即結(jié)合上保護(hù)單鏈。（3）RNA引物的合成

引物合成酶結(jié)合上去，形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的引發(fā)體。引物合成酶合成引物。

目前二十四頁\總數(shù)四十五頁\編于四點起始：OriC開始，形成復(fù)雜的引發(fā)體，合成RNA引物目前二十五頁\總數(shù)四十五頁\編于四點2、延伸－酶催化以高速度進(jìn)行在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，根據(jù)模板鏈3’→5’的核苷酸順序，從引物游離3’－OH開始加入脫氧核苷酸，直至合成整個DNA片斷。酶的催化方向：5’→3’，所以新生DNA鏈的延伸方向也是5’→3’。兩條鏈復(fù)制又同時進(jìn)行。如何解決？一條鏈連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈；另一條鏈不連續(xù)合成，為滯后鏈。岡崎片斷：以DNA5’→3’鏈為模板時合成的不連續(xù)的較短的DNA片斷。目前二十六頁\總數(shù)四十五頁\編于四點’ThemodelofDNA-polIII

formthecatalyticcore

LinkstwocoresLeadingstrandsynthesisLaggingstrandsynthesisactasaclamp目前二十七頁\總數(shù)四十五頁\編于四點復(fù)制過程：兩條鏈同時進(jìn)行目前二十八頁\總數(shù)四十五頁\編于四點聚合酶Ⅰ切除引物連接酶連接岡崎片斷聚合酶Ⅲ合成岡崎片斷目前二十九頁\總數(shù)四十五頁\編于四點3、終止兩復(fù)制叉在終止區(qū)相遇，形成的連鎖體由拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ分開。終止子ter和終止蛋白Tus防止復(fù)制叉超過終止區(qū)過界復(fù)制。目前三十頁\總數(shù)四十五頁\編于四點目前三十一頁\總數(shù)四十五頁\編于四點第三節(jié)真核生物DNA的復(fù)制真核DNA的合成的基本過程類似于原核DNA，不同之處：多復(fù)制起點至少有五種聚合酶αβγδε

端粒的復(fù)制依賴于端粒酶

目前三十二頁\總數(shù)四十五頁\編于四點（1）真核細(xì)胞多復(fù)制起點目前三十三頁\總數(shù)四十五頁\編于四點（2）真核生物DNA聚合酶真核生物至少擁有5種DNA聚合酶，分別命名為α、β、γ、δ及ε。能在5’→3’方向聚合DNA鏈，但功能不盡相同。真核細(xì)胞中與DNA復(fù)制有關(guān)的酶是DNApolα（合成引物）和δ(合成前導(dǎo)鏈和滯后鏈）。δ還具有3’→5’外切酶的校正功能，并具有解螺旋的作用。酶β和ε：參與修復(fù)。酶γ參與線粒體DNA復(fù)制。目前三十四頁\總數(shù)四十五頁\編于四點（3）端粒及端粒酶真核生物染色體DNA是線性的，每復(fù)制一次，子鏈的5’有缺失。3’端有特殊的序列,是線性DNA末端復(fù)制必需的---端粒作用：穩(wěn)定染色體目前三十五頁\總數(shù)四十五頁\編于四點線形DNA復(fù)制末端問題5’3’5’3’5’3’5’3’目前三十六頁\總數(shù)四十五頁\編于四點端?？s短目前三十七頁\總數(shù)四十五頁\編于四點目前三十八頁\總數(shù)四十五頁\編于四點第四節(jié)反轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄：在RNA指導(dǎo)下DNA的合成。即以RNA為模板，合成DNA的過程。此過程和一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)。反轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶。

目前三十九頁\總數(shù)四十五頁\編于四點反轉(zhuǎn)錄酶的活性

①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性：由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。目前四十頁\總數(shù)四十五頁\編于四點RNA模板逆轉(zhuǎn)錄活性RNaseH活性RNA:DNA雜化雙鏈單鏈DNADNApol活性整合(integration)入細(xì)胞基因組雙鏈DNA

病毒基因組通過基因重組插入到宿主細(xì)胞基因組中，稱為整合。tRNA引物目前四十一頁\總數(shù)四十五頁\編于四點逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與宿主細(xì)胞DNA整合，可能導(dǎo)致癌變！病毒DNA隨宿主細(xì)胞復(fù)制，轉(zhuǎn)錄生成RNA并翻譯成蛋白。RNA和蛋白組裝成病毒。目前四十二頁\總數(shù)四十五頁\編于四點第五節(jié)DNA的損傷修復(fù)一、DNA的損傷（突變）的概念DNA分子一級結(jié)構(gòu)的改變稱為DNA損傷(DNAdamage)或突變（mutation）。自發(fā)突變：大多數(shù)突變屬此類，原因不明。誘發(fā)突變：由理化因素誘發(fā)物理因素（紫外、高能射線、電離輻射）化學(xué)因素（5-F-U，烷基化試劑、亞硝酸鹽、堿基類似物）目前四十三頁\總數(shù)四十五頁\編于四點二、突變的類型1.點突變（pointmutation）