基因表達(dá)沉默技術(shù)

基因表達(dá)沉默技術(shù)1第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一教學(xué)內(nèi)容及要求1234反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)基因敲除技術(shù)RNA干擾技術(shù)重點(diǎn)熟悉2第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一參考資料《基因工程及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)-基因工程分冊》，北京大學(xué)出版社，靜國忠編自備材料（個人實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)）3第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)RNA干擾技術(shù)4第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一基本概念掌握RNA干擾(RNAinterference,RNAi):由小雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。小干擾RNA:具有干擾功能的這種短雙鏈RNA就稱為小干擾RNA（SmallinterferingRNA,siRNA)。5第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一注射sense秀麗線蟲antisense注射1995年．．．．．．發(fā)現(xiàn)歷史6第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一反義RNA(antisenseRNA)對基因抑制效應(yīng)比較微弱；而雙鏈RNA（dsRNA）能夠高效特異性阻斷靶基因的表達(dá)。

animportantfinding?。?998年7第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一

CraigC.Mello

克雷格·梅洛AndrewZ.Fire安德魯·菲爾2006NobelPrizeinPhysiologyorMedicine8第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi也存在于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。RNAi現(xiàn)象的普遍性9第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一靶RNAi機(jī)制siRNA在ATP參與下形成RISC復(fù)合體，被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中的反義鏈指導(dǎo)移至靶mRNA，靶mRNA被切割后誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。外源長dsRNA在ATP作用下被RNaseⅢDicer切割成21nt左右、由正義和反義鏈組成的siRNA重點(diǎn)10第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一siRNA19bpduplex2nt3’overhangs21ntsiRNA實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)難點(diǎn)11第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一1）靶序列的調(diào)出NationalCenterfor

BiotechnologyInformation

12第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一13第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一14第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一2）利用免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)InvitrogenTakaraOligoegine

15第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一軟件的選擇原則1、選擇可讀框內(nèi)、翻譯起始位點(diǎn)之后50～100nt的序列作為靶序列；2、選擇的靶位5’端之前的兩個堿基為AA；3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；4、堿基數(shù)目控制在19～21nt；5、避免連續(xù)3個或3個以上的相同堿基；6、避免重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)以免形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；7、靶序列同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對。16第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一我用的軟件：siDirect17第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一3）siRNA合成或表達(dá)RNA聚合酶Ⅲ啟動子（包括U6或H1）：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)明確；轉(zhuǎn)錄生成小RNA；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無polyA尾；轉(zhuǎn)錄終止為5個連續(xù)的U。18第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一19第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一20第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一21第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一3mg/ml正向引物1μl3mg/ml反向引物1μl90°C4min70°C10min室溫訂購合成的引物序列退火22第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一4)siRNAworking?23第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一mRNA:Real-timePCRProtein:Westernblot17siRNAMock24第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一5)合成or構(gòu)建載體？化學(xué)合成siRNA：

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)花費(fèi)高使用的時(shí)候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理過的滅菌蒸餾水溶解，這是因?yàn)閟iRNA易被RNA酶降解。B.載體：為了長期觀察基因沉默后的影響，需要長期表達(dá)siRNA。C.載體選擇：易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用質(zhì)粒載體，難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用逆轉(zhuǎn)錄載體或慢病毒載體。25第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一6）體外導(dǎo)入細(xì)胞a.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：＋＋＋＋＋－－－－－－＋具體操作步驟：按照脂質(zhì)體說明書進(jìn)行26第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一b.電穿孔導(dǎo)入：27第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一c.病毒感染（以腺病毒為例）：28第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一next29第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)反義核酸技術(shù)30第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一1978年，Stephenson和Zamecnik首次報(bào)道了反義寡脫氧核苷酸可抑制勞斯肉瘤病毒RSV的復(fù)制現(xiàn)象。1984年，Izantweintraub提出了“反義核酸技術(shù)”的概念。InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide.ProcNatlAcadSciUSA,1978;75:285-288.歷史由來31第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一反義寡核苷酸概念：正義鏈互補(bǔ)的一段核苷酸序列，包括反義DNA和反義RNA?；靖拍罘戳xRNA技術(shù)反義DNA技術(shù)32第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一反義抑制的主要機(jī)理直接作用于靶mRNA的SD序列或部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶H降解。反義核酸mRNARNaseH33第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一論著超過１６０００篇。基因功能研究（1994年流行）

如抗病毒或抗腫瘤基因治療研究等領(lǐng)域。反義核酸應(yīng)用34第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一1998年8月27日，美國食品藥品管理局（FDA）正式批準(zhǔn)了由ISIS公司開發(fā)的全球第一個反義藥物“Vitravene”（福米韋生，fomivirsen）在美國上市。該藥抗病毒作用較強(qiáng)，是更昔洛韋的1000倍，用于治療巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎和艾滋病人并發(fā)巨細(xì)胞視網(wǎng)膜炎,有效率高達(dá)80%-90%。Vitravene為注射劑，患者每月只需注射一次藥物（利用專用針頭直接注射進(jìn)眼球內(nèi)），不良反應(yīng)有虹膜炎、玻璃體炎，發(fā)生率為25％，用糖皮質(zhì)激素治療可緩解或消除其炎性反應(yīng)。2１個硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸組成５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇

35第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一a.避免內(nèi)源性核酸酶對其降解b.提高自身穩(wěn)定性以及與靶分子的親和力Hdeoxyribose提高有效性技術(shù)難點(diǎn)修飾36第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一第一代硫代修飾（Phosphorothioate）ResistingToNucleases；ActivatingRNaseHpathwaysO37第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一第二代修飾(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl)ResistingToNucleases；notactivatingRNaseHpathways38第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一2001主要用于治療老年人中十分常見的視網(wǎng)膜黃斑退化癥

Macugen哌加他尼39第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一

2003新一代抗HIV新藥，屬于病毒的融合阻止劑類藥物

Fuzeon

20570$40第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一Tysabri2004專治多發(fā)性硬化癥

41第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一next42第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)核酶技術(shù)43第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一核酶（ribozyme）ribonucleicacidenzyme具有催化活性的RNA，化學(xué)本質(zhì)是RNA,卻具有酶的催化功能。基本概念44第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一切赫(T.R.Cech)（1947-），美國人,他獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)四膜蟲轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物rRNA前體，可切除自身的413個核苷酸的內(nèi)含子，使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。歷史由來ThomasR.Cech1982

45第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一S.Altman研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RNaseP的蛋白質(zhì)部分除去后，留下RNA能夠切割rRNA前體的5’端。1983

46第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一1989NobelPrizeinChemistry核酶的發(fā)現(xiàn)改變了“所有酶都是蛋白質(zhì)”的傳統(tǒng)觀念47第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一

有封閉切割RNA應(yīng)用——阻斷基因的表達(dá)（1994年左右比較流行的研究工具）48第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一通常由60個核苷酸左右組成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13個堿基。錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)示意圖49第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一next50第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)基因敲除技術(shù)時(shí)間：80年代末功能：建立基因失活或缺失的動物模型51第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)展歷史a.胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES）分離培養(yǎng)取自小鼠受精卵發(fā)育第4，5天的胚胎細(xì)胞能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性

1981年，馬丁·埃文斯(MartinJ．Evans)從正常的小鼠囊胚中分離到了ES細(xì)胞。小鼠ES細(xì)胞的分離和應(yīng)用是ES細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的里程碑。52第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一同源重組：是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中相同或者相似DNA序列間的重組，通常通過一對同源分子非姊妹染色體間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片段。b.同源重組技術(shù)應(yīng)用53第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一1985年，奧利弗·史密塞斯(OliverSmithies)等首次報(bào)道在腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了人工打靶載體和內(nèi)源β-球蛋白基因間的同源重組。54第54頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一1988年，卡佩基安德等發(fā)展了一種稱為“正負(fù)篩選”的策略，將胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打靶載體的外側(cè)，作為篩選的負(fù)性標(biāo)記。這比單用陽性篩選正確克隆富集的倍數(shù)高3~10倍，真正使得同源重組技術(shù)得以應(yīng)用。馬里奧·卡佩基安德(MarioR．Capechiand)丙氧鳥苷55第55頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一MartinEvans馬丁·埃文斯MarioCapecchi馬里奧·卡佩基OliverSmithies奧利弗·史密斯56第56頁，共62頁，2023年，2月20日，星期一原理