西尼羅病的研究進(jìn)展及診斷技術(shù)

西尼羅病的研究進(jìn)展及診斷技術(shù)第1頁(yè)/共27頁(yè)十大導(dǎo)致動(dòng)物死亡的疾病埃博拉-大猩猩壺菌病-蛙類和蠑螈西尼羅腦炎-鳥類，人類和馬白鼻癥-蝙蝠炭疽-主要影響食草動(dòng)物，同時(shí)會(huì)感染一些哺乳動(dòng)物，包括肉食動(dòng)物、人猿和人類袋獾面部腫瘤-澳大利亞的塔斯馬尼亞袋獾犬瘟-肉食野生動(dòng)物衣原體病毒-考拉常患的性病疥螨-影響超過(guò)100多種不同的物種，從澳大利亞袋熊，到紅狐，歐洲猞猁和北美狼

瘟疫-臭名昭著的黑死病，鼠疫桿菌，野生嚙齒動(dòng)物第2頁(yè)/共27頁(yè)簡(jiǎn)介西尼羅病是由西尼羅病毒（(WestNileVirus,WNV）引起的，是一種人獸共患病。近年來(lái)西尼羅病毒病出現(xiàn)在歐洲和北美的溫帶區(qū)域，對(duì)人和動(dòng)物的健康構(gòu)成了威脅。

西尼羅病毒最初是1937年從烏干達(dá)西尼羅地區(qū)一名發(fā)熱的婦女血液中分離出來(lái)而被發(fā)現(xiàn)，因此得名為西尼羅病毒。此后在以色列、法國(guó)、南非、阿爾及利亞和俄羅斯等國(guó)都有過(guò)暴發(fā)流行。第3頁(yè)/共27頁(yè)生物學(xué)特征西尼羅病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬，與乙型腦炎、圣路易腦炎、黃熱病、登革熱、丙型肝炎等病毒同屬。單股正鏈RNA病毒，約有10000～11000個(gè)堿基對(duì)，具有感染性。電鏡下該病毒呈中等大小，直徑21nm～60nm,圓形顆粒，有囊膜，核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)為病毒結(jié)構(gòu)蛋白。對(duì)有機(jī)溶劑，紫外線敏感。第4頁(yè)/共27頁(yè)流行病學(xué)----傳染源：主要為鳥類。超過(guò)80%的感染者只是輕微癥狀或無(wú)癥狀，其中只有約1%會(huì)發(fā)生腦炎并死亡，因此患者和隱形感染者也是該病毒的傳染源。第5頁(yè)/共27頁(yè)流行病學(xué)----傳染途徑傳播途徑主要是在蚊類和鳥之間循環(huán)，典型的鳥宿主蟲媒病毒，蚊類主要是庫(kù)蚊，在歐洲和北美尖音庫(kù)蚊是主要媒介，在亞洲則是三帶喙庫(kù)蚊和致乏庫(kù)蚊。病毒在鳥體內(nèi)循環(huán)，產(chǎn)生高水平的病毒血癥,蚊子叮咬病鳥后被感染。WNV存在于蚊子的唾液腺里,當(dāng)其再叮咬其它動(dòng)物時(shí)即發(fā)生感染。在干旱、蚊蟲少的地區(qū),可能存在蜱—鳥—蜱的傳播周環(huán)。第6頁(yè)/共27頁(yè)流行病學(xué)----終末宿主哺乳動(dòng)物因?yàn)槿撕婉R等哺乳動(dòng)物感染W(wǎng)NV之后,只會(huì)引起短暫的低水平病毒血癥,所以普遍認(rèn)為其是終末宿主。第7頁(yè)/共27頁(yè)流行病學(xué)----發(fā)病主要季節(jié)主要發(fā)生在夏末或秋初,而在美國(guó)南部的氣候條件下,全年都可以發(fā)生。第8頁(yè)/共27頁(yè)臨床癥狀病鳥的癥狀包括厭食、失重、嗜睡和羽毛帶血脫落,晚期鳥可有頭顫動(dòng)、綠尿酸(鹽)、血尿、中心盲視、對(duì)周圍環(huán)境無(wú)知覺、腿笨拙脆弱和死前嚴(yán)重顫動(dòng)等癥狀。感染W(wǎng)NV存活者可能受腦部破壞或其他生理功能退化影響，包括干擾鳥的導(dǎo)航技能。對(duì)存活鳥機(jī)體內(nèi)部病理?yè)p傷包括腎、胰和心臟的損傷。感染W(wǎng)NV后無(wú)癥狀的存活者不一定是沒有損傷的。第9頁(yè)/共27頁(yè)病毒存在部位病毒血癥減弱后,病毒顆粒和病毒RNA仍可在一些鳥的組織中存在。在鳥卵巢和睪丸組織中檢測(cè)到病毒顆粒,增加了成鳥經(jīng)卵傳遞病毒的可能性。有些鳥腎中有高濃度病毒,25種實(shí)驗(yàn)鳥大部分在感染期均可從口腔和泄殖腔中檢測(cè)到病毒顆粒,這對(duì)糞-口傳播的可能有重要提示。第10頁(yè)/共27頁(yè)診斷方法病原學(xué)診斷血清學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷第11頁(yè)/共27頁(yè)診斷方法—病原學(xué)診斷病毒分離鑒定抗原捕獲ＥＬＩＳＡ基于膜的電化學(xué)生物傳感器技術(shù)第12頁(yè)/共27頁(yè)診斷方法—血清學(xué)診斷補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)基于微球的免疫測(cè)定方法表面增強(qiáng)拉曼散射ＥＬＩＳＡELISA方法快速、重復(fù)性好、成本低、通量大，近年來(lái)發(fā)展迅速，已經(jīng)建立了IgG間接ELISA（IgM－ELISA）、IgM抗體捕獲ELISA（MAC－ELISA）和阻斷ELISA（blocking－ELISA）等第13頁(yè)/共27頁(yè)診斷方法—分子生物學(xué)診斷ＲＴ－ＰＣＲＲＴ－ｎＰＣＲReal-timeＲＴ－ＰＣＲ實(shí)時(shí)快速反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)第14頁(yè)/共27頁(yè)治療及預(yù)防目前臨床尚無(wú)西尼羅病毒疫苗獲準(zhǔn)上市處在臨床試驗(yàn)階段的有ChimeriVax(Ⅱ期臨床)、WN-DEN4(Ⅱ期臨床)和VRC303(Ⅰ期臨床)，已有3種獸用疫苗WestNile-Innovator、Vetera和Recom-bitek獲準(zhǔn)上市第15頁(yè)/共27頁(yè)治療及預(yù)防防止蚊蟲在春季的大量繁殖?？赏ㄟ^(guò)加強(qiáng)水體管理，使用化學(xué)和生物學(xué)方法阻斷幼蟲的繁殖。應(yīng)儲(chǔ)備足夠的噴灑用化學(xué)藥物，以應(yīng)付攜帶WNV成蚊的大量出現(xiàn)。第16頁(yè)/共27頁(yè)治療及預(yù)防個(gè)人防護(hù)：加強(qiáng)個(gè)人的防蚊意識(shí)，蚊蟲活動(dòng)高峰時(shí)間盡量減少外出，外出時(shí)應(yīng)著長(zhǎng)袖衣褲等第17頁(yè)/共27頁(yè)治療及預(yù)防出入境衛(wèi)生檢疫：加強(qiáng)出入境衛(wèi)生檢疫，特別是在WNV流行季節(jié)，對(duì)來(lái)自流行區(qū)的貨物、交通運(yùn)輸工具等應(yīng)做好滅蚊處理。做好動(dòng)物特別是鳥類的入境檢疫工作。對(duì)來(lái)自流行區(qū)的人員，如果出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、皮疹、淋巴結(jié)腫大等相關(guān)癥狀，應(yīng)提高警惕，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查，一旦確診為WNV感染，應(yīng)立刻采取相應(yīng)措施，進(jìn)行防蚊隔離治療。第18頁(yè)/共27頁(yè)國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀迄今為止，我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)WNV感染的臨床病例，我國(guó)存在WNV傳入的自然條件：作為WNV宿主的鳥類品種繁多，有多種庫(kù)蚊屬蚊可以傳播WNV，它們幾乎分布于除內(nèi)蒙古、青海等少數(shù)省份以外的我國(guó)各地。隨著國(guó)際交流的日益頻繁，WNV傳入我國(guó)境內(nèi)的可能性非常大。此外，目前我國(guó)每年都有相當(dāng)數(shù)量病因不明的病毒性腦炎臨床病例，由于國(guó)內(nèi)尚未對(duì)WNV引起足夠的重視及開展進(jìn)一步研究，因此，也不能完全排除已存在WNV感染病例的可能性，對(duì)WNV應(yīng)提高警惕。第19頁(yè)/共27頁(yè)Thanks!第20頁(yè)/共27頁(yè)病毒分離與鑒定病毒檢測(cè)的金標(biāo)方法該病毒的分離所需時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)樣品要求高，且需在生物安全Ⅲ級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法：將腦脊髓液、血液或組織器官等樣品的上清液接種到Vero、RK-13或AP61等細(xì)胞單層，每天觀察細(xì)胞病變（cytopathiceffect，CPE），如果CPE不明顯可以結(jié)合間接免疫熒光方法進(jìn)行鑒定，也可以使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。第21頁(yè)/共27頁(yè)抗原捕獲ELISA用制備的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的單克隆抗體和兔高免血清分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體用以檢測(cè)感染W(wǎng)NV的的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1第22頁(yè)/共27頁(yè)基于膜的電化學(xué)納米生物傳感技術(shù)將針對(duì)Ｅ蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的lgＭ抗體作為識(shí)別WNV粒子的探針，建立了基于膜的電化學(xué)納米生物傳感技術(shù)用于檢測(cè)WNV粒子或病毒的Ｅ蛋白。該方法可以檢測(cè)２個(gè)病毒粒子/100mL，靈敏度非常高，可以和PCR技術(shù)相媲美。這種方法對(duì)于病毒感染早期的診斷比較有用，此時(shí)宿主機(jī)體內(nèi)尚未出現(xiàn)抗體第23頁(yè)/共27頁(yè)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)檢測(cè)馬血清中NS1抗體的檢測(cè)方法將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的WNVＥg101毒株的NS1蛋白作為抗原，滅活的待檢血清和細(xì)胞孵育后加入補(bǔ)體，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放乳糖脫氫酶，通過(guò)檢測(cè)乳糖脫氫酶從而檢測(cè)血清中NS1抗體第24頁(yè)/共27頁(yè)基于微球的免疫測(cè)定方法該技術(shù)基于抗原與微球的共價(jià)結(jié)合，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，可在幾小時(shí)內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果.用于檢測(cè)接種疫苗或自