抗體工程,蛋白質工程

第一節(jié)

單克隆抗體目前一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點淋巴細胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體目前二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點目前三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能。利用腫瘤細胞無限增殖的特性。利用細胞融合的技術將兩種細胞融合獲得具有B淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞。利用動物細胞培養(yǎng)技術大量培養(yǎng)雜交瘤細胞。目前四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點單克隆抗體的概念：由單個雜交瘤細胞進行無性繁殖,也就是通過克隆，形成細胞群，這一細胞群所產(chǎn)生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。

目前五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體如何獲得融和細胞？如何得到單個融和細胞？如何篩選雜交瘤細胞？鑒別是否分泌所需抗體?目前六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點雜交瘤細胞的篩選(1)骨髓瘤細胞：為HGPRT基因缺陷型細胞，不能合成DNA。需經(jīng)應急途徑合成DNA。HAT培養(yǎng)基含有次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻斷骨髓瘤細胞的應急DNA合成。所以骨髓瘤細胞不能在HAT培養(yǎng)基中生長存活.B淋巴細胞具有HGPRT基因但不能在體外生長。利用這兩種細胞各自的特點，篩選能在體外含HAT的培養(yǎng)基中生長的融合子。HGPRT:次黃嘌呤核糖磷酸轉移酶HAT：次黃嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶目前七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點雜交瘤細胞的篩選(2)目前八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點目前九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細胞第二次篩選（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測）：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞。目前十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體目前十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點鑒定后的雜交瘤細胞可大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清提取單克隆抗體，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水來制備相應的McAb，但生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量均受限制。目前十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點單克隆抗體的優(yōu)勢1．高特異性，針對一個抗原靶點。。2．高純度，成份均一，來自一個克隆。3．高效價，抗體的滴度高。4．高效益，國際上近100億美元市場。5．易制備。6．前景好，McAb1995問世后，風糜全球，寄予厚望。目前十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點單克隆抗體應用領域1．McAb作為診斷試劑應用：這是目前應用最廣的領域，目前已有許多成套的診斷試劑盒在診斷傳染病，代謝病和免疫性疾病中應用，取得良好經(jīng)濟和社會效益，全世界有上百億市場。舉例：早孕試紙，乙肝診斷試劑盒目前十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點2．抗體導向治療

用特異性單抗為載體，將抗瘤藥物、放射性核素以及毒素等毒性物質導向性攜帶至腫瘤灶局部，可特異性殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞損傷較輕。將毒素與單抗連接常稱為免疫毒素。常用的毒素包括植物毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和細菌毒素（如白喉外毒素、綠膿桿菌外毒素等）。目前十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點目前十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點3．McAb作免疫抑制劑應用，應用于器官移植。當前McAb最具代表的是抗TNF單抗治療類風濕和回腸炎有效，有20億美元市場。其他在抗腫瘤，抗排異及抗血栓方面也很看好。目前十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點1980年后，其開發(fā)走向下坡路，臨床實驗失敗，股票狂跌，損失以百萬美元計。原因：病人過敏及免疫性疾病加重病人病情，體內很快排異及對腎臟毒性。但到2000年又有回頭，2001年被認為在免疫學上是“單克隆抗體年”，抗體研究將迅速發(fā)展，現(xiàn)單在治療方面就有10種單抗進入市場，3種待批上市，近100種在進行臨床試驗階段。當然，與McAb技術改進關系極大。目前十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內診斷，借以鑒別和定位體內“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。目前十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

問題異源蛋白導致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果在體內被清除速度快靶部位攝取的量太低效應功能弱產(chǎn)業(yè)化

對策抗體人源化抗體人源化改變抗體分子大小連接毒素、放射性同位素、藥物體外表達抗體抗體治療存在的問題及對策目前二十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點基因工程抗體通過基因重組改良抗體性能通過噬菌體抗體庫技術研制新的抗體目前二十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點免疫球蛋白分子的基本結構目前二十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點第二節(jié)

鼠單抗人源化目前二十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點●恒定區(qū)人源化——人-鼠嵌合抗體●可變區(qū)人源化——人改型抗體●用抗體庫技術進行人源化目前二十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

第一代的抗體人源化—嵌合抗體

從雜交瘤細胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當表達載體，轉染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體。嵌合抗體由于這兩部分在空間結構上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好。特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結合抗原的能力。缺點：因鼠單抗可變區(qū)的存在，應用時仍有較強的免疫排斥反應目前二十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉染細胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略目前二十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細胞人-鼠嵌合基因工程抗體目前二十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點第二代的抗體人源化——改型抗體

在嵌合抗體的基礎上進一步將鼠MAb可變區(qū)中相對保守的FR(frameworkregion)替換成人的FR，保留與抗原結合部位決定簇互補區(qū)（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)早期的改型抗體：簡單的CDR移植，通過點突變進行微調即更換某個位點上的氨基酸。目前二十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）目前二十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點第二代改型抗體：①應用了人抗體基因庫；②引進計算機技術模擬抗體分子的立體結構(分子模擬法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體

目前三十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點31已批準上市的單抗適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥大腸癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎癥性腸病、類風濕CD317-1A血小板受體ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠單抗鼠單抗人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體19861995(德國)1994199719981998、1999目前三十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點32適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗體人源化抗體人源化抗體人源化抗體－化療藥物交聯(lián)物人源化抗體19971998199820002001目前三十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點第三節(jié)

小分子抗體目前三十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

小分子抗體通過基因重組技術，可以在保持原有抗原結合活性的基礎上，把完整的抗體分子改造成較小的分子，稱為小分子抗體。根據(jù)其價數(shù)的不同可分為單價小分子抗體及多價小分子抗體兩種。目前三十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點單價小分子抗體一、Fab抗體Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。目前三十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點二、單鏈抗體(ScFv)

定義：用基因工程方法，將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，功能：具有較好的抗原結合能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特性?？膳c其他效應分子構建成多種具有新功能的抗體分子，是構建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元件。Ag目前三十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點三、單域抗體

抗體與抗原的結合主要由Ig的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL一個功能結構域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個Ig分子的1／12，故也稱之為小抗體。目前三十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點四.超變區(qū)多肽

抗體抗原結合是經(jīng)過補體決定區(qū)（CDR）來實現(xiàn)。因此，CDR是構成抗原抗體結合的最小結構單位。根據(jù)這一特點，可以設計出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結果。這種只含有一個CDR多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽，亦稱為最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)。目前三十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

多價小分子抗體在ScFv的基礎上，可以把兩個或兩個以上的ScFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。其中包括雙鏈抗體(diabody)，微型抗體（minibody），三鏈抗體(triabody)及四鏈抗體(tetrabody)等。

目前三十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點AgAg雙鏈抗體(diabody)制備方法化學交聯(lián)法粘性蛋白結構域融合法接頭長度控制法。目前四十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點微型抗體(minibody)

通過基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗體(VL-VH)的VH結構域與IgG的CH3結構域融合，形成VL-VH-CH3的結構，稱之為微型抗體（minibody）。此種抗體合成后通過CH3結構域形成穩(wěn)定二聚體式，發(fā)揮其雙價微抗作用。目前四十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

小分子抗體的應用：用于腫瘤的導向治療腫瘤的影像分布基因治療研究基因結構與功能的關系目前四十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點第四節(jié)

抗體融合蛋白目前四十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點抗體融合蛋白：將抗體分子片段與其他蛋白融合，所形成的具有新的特性融合蛋白。根據(jù)構建方式的不同，主要分為兩種形式：Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗體的Fc段與某些具有特定功能的蛋白結構域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成抗原結合融合蛋白（antigen-Bindingfusionprotein,ABFP）由具有抗原結合功能的抗體結構與其他功能性蛋白融合構成。如免疫毒素，抗體部分主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。目前四十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點免疫毒素：又稱生物導彈，是由導向性的載體分子（抗體部分）與具有毒性的彈頭蛋白交聯(lián)而制成，屬于導向藥物的一種。目前四十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）RicinA:蓖麻毒素A,對腫瘤細胞具有毒性作用目前四十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫細胞因子(Immunocytokine)目前四十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點偶連細胞毒物質連接放射性同位素(131I、99mTc）連接植物或細菌毒素（ricin、PE40）連接細胞毒性藥物（C1027、柔紅霉素）目前四十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

免疫粘附素(immunoadhension)：將人抗體恒定區(qū)(主要是Fc段)N-端連接于人細胞表面的受體分子或細胞粘附分子上，在真核細胞中表達出正確折疊的融合抗體蛋白分子。Fc段發(fā)揮的作用（1）增加融合蛋白在血液中的穩(wěn)定性。（2)Fc的生物學效應引導向特定細胞。比如：TNF-a抗體與TNFR-Fc

目前四十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點第五節(jié)

噬菌體抗體庫技術(phageantibodylibrary)

目前五十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點一、噬菌體展示系統(tǒng)將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內。目前五十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌體展示技術目前五十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點目前五十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點1Panlibrarywithimmobilizedtargets2Washoffunboundphage3Eluteboundphage4Amplifyovernight5Panelutedphage6Isolateindividualcolony3-4?2004MontaropYamabhai目前五十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點二、噬菌體抗體庫運用DNA重組技術把人抗體基因與噬菌體載體DNA相連，在噬菌體表面呈現(xiàn)并制備人類全套抗體的技術。phageantibodylibraryphageantibodybank

目前五十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。目前五十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點因此,噬菌體抗體庫技術不經(jīng)免疫不經(jīng)細胞融合技術即可獲得含量豐富、種類眾多的單一抗體技術。目前五十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導系列的緊靠下游隨機克隆入相應載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段（一）噬菌體抗體庫技術基本方法目前五十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點用固相化抗原經(jīng)“親和結合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細菌的質周腔內，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉入大腸桿菌，目前五十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

1．抗體基因的擴增:

利用PCR技術，從外周B淋巴細胞DNA中分別擴增出輕鏈、重鏈可變區(qū)的基因。也可從B細胞mRNA中，經(jīng)逆轉錄為cDNA后再擴增。除B細胞外，外周淋巴細胞、脾、淋巴結和骨髓細胞也可選用。顯而易見，此法除了引物設計十分重要外，還要考慮機體免疫狀態(tài)、細胞種類和數(shù)量、mRNA豐度等影響。目前六十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

引物設計，一般可選：①5ˊ端引物選Ig前導肽保守序列，5ˊ端引物也可選Ig分子骨架區(qū)1(FR1)的保守序列。②3ˊ端引物常選J區(qū)保守序列。構建Fab基因庫，則在重鏈絞鏈區(qū)和輕鏈恒定區(qū)設計引物。③依據(jù)抗體基因家族保守序列設計引物。④設計多套引物分別擴增。為保證引物與模板最大的匹配，擴增出所有基因，有時尚須采用兼并引物。目前六十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點選用絲狀噬菌體(M13、fd)，其DNA呈單鏈。一般在其外殼蛋白基因信號肽序列與編碼成熟的蛋白序列之間插入外源基因：人Ig基因片段。用特定的限制性內切酶酶解擴增出來的cDNA，克隆進入絲狀噬菌體載體中，即與外殼蛋白pⅢ或pⅧ的基因連接形成融合基因。2．噬菌體表達載體的構建目前六十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

一般插入后不影響表達系統(tǒng)功能，在此融合基因中，人Ig基因片段多位于噬菌體基因的上游5ˊ端，在細菌中可以表達。一般作用的載體都是經(jīng)過改建的，即含有LacZ啟動子、核糖體結合位點(SD序列)、前導肽序列(保證分泌)和多克隆位點等，其后為M13外殼蛋白(pⅢ或pⅧ)。目前六十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點噬菌體抗體圖示目前六十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點3．重組噬菌體DNA導入細菌進行人Ig片段表達

表達出的人Ig片段位于噬菌體外殼蛋白N端，但此融合蛋白不形成包涵體，在細菌信號肽引導下到達質周腔，Ig片段在此能自發(fā)折疊成天然狀態(tài)，恢復生物活性。同時，外殼蛋白構成噬菌體外殼后，抗體分子蛋白處于其N端，分布在噬菌體表面。目前六十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點抗體庫的構建目前六十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點4單鏈噬菌體有效篩選

抗體庫建立后,用可溶性抗原去篩選表達的抗體，在篩選流感病毒血凝素抗體、破傷風類毒素抗體時證明，篩選率很低。需要改進和提高產(chǎn)率。目前六十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

制備固相化抗原柱

人體內是通過抗原的提呈作用，選擇表面呈現(xiàn)特異抗體的B細胞和增殖分泌抗體的漿細胞。并在抗原選擇壓力下發(fā)生改變，產(chǎn)生出具有不同親和力抗體。為了模擬此選擇作用，在體外用固化抗原柱篩選噬菌表面抗體，再利用噬菌體能感染大腸桿菌特性，確重新感染細菌進行擴增。固相多用層析柱，也有用顆粒物質和酶聯(lián)孔的。目前六十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

抗體庫噬菌體過柱

選擇目的抗體把含有抗體的噬菌體培養(yǎng)上清加到抗原固相柱上，使表面呈現(xiàn)特異性抗體的噬菌體與抗原特異性結合，洗去未結合的噬菌體。此時，抗原柱吸附的帶抗體的噬菌體是具有感染性,表面所帶抗體是所需的特異抗體片段。顯然，只要制備不同抗原柱，就可篩選到針對不同抗原的不同抗體。目前六十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

6．洗脫結合的噬菌體

選擇合適洗脫條件，把結合的、也是所需的噬菌體洗下來，收集噬菌體，再去感染細菌進行擴增。經(jīng)過這樣一來一輪淘篩方式，就能把抗體庫中與抗原特異性結合抗體選出來，且能夠做到富集。目前七十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點抗體庫的富集篩選目前七十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點7．重復“吸附—洗脫—擴增”過程

由于每徑過一輪淘篩，可富集20～1000倍，幾輪后很容易擴增到108個噬菌體體庫。目前七十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點（二）應用1．應用“萬能庫”,制備人源抗體、多功能抗體

不經(jīng)免疫已獲得許多人的抗半抗原、蛋白質、多糖及病毒等抗體。2．抗感染：傳染病診斷、治療和預防(當前重點、熱點)。3．抗腫瘤：腫瘤和其他疾病的導向治療和基因治療。目前七十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點4．利用抗體信息設計藥物。5．噬菌體表位文庫，可用此表達系統(tǒng)表達特異多肽后，建立肽庫（peptidelibrary）。目前七十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點蛋白質工程(proteinengineering）目前七十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點蛋白質的結構及其多樣性目前七十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點①氨基酸種類不同，肽鏈結構不同

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◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎蛋白質多樣性原因②氨基酸數(shù)目成百上千，肽鏈結構不同③氨基酸排列順序千變萬化，肽鏈結構不同☆-☆-○-◎-

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-④肽鏈空間結構千差萬別，蛋白質種類不同目前七十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點天然蛋白質是生物在長期進化過程中形成的，它們的結構和功能符合特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。目前七十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質。蛋白質工程就是為了生產(chǎn)出符合人類生產(chǎn)和生活需要的蛋白質，甚至是自然界不存在的蛋白質。目前七十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點滿足人類生產(chǎn)和生活的需要改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍改造目前八十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點例如．胰島素改造天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這是胰島素B23-B28氨基酸殘基結構所致。利用蛋白質工程技術改變這些殘基，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過臨床實驗。

目前八十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點二、蛋白質工程的基本原理

根據(jù)人們對蛋白質功能的特定需求，對蛋白質的結構進行分子設計。對天然蛋白質進行改造，你認為應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？目前八十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點蛋白質的功能是DNA決定的，那么要制造出新的蛋白質，就要改造DNA，所以蛋白質工程的原理應該是中心法則的逆推。蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程。目前八十三頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點蛋白質工程的基本原理基因DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質三維結構預期功能生物功能mRNA轉錄翻譯折疊DNA合成分子設計目前八十四頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點蛋白質工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質的二維重組和三維晶體結構;（4）設計各種處理條件，了解蛋白質的結構變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。目前八十五頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點蛋白質結構測定一級結構測定：直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序。間接法：從編碼蛋白質的基因的核苷酸順序來推導蛋白質的氨基酸順序。三級結構測定：X-射線晶體衍射——研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質的空間結構核磁共振(NMR)光譜——研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質的結構。目前八十六頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點蛋白質工程的主要手段以重組DNA技術為核心的基因工程技術改造蛋白質。位點特異性突變——結構生物學、信息生物學基因突變隨機突變——基于高通量篩選法基因內部的剪接基因剪接5‘或3’端的剪接目前八十七頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點小改是對天然蛋白質的一個或幾個氨基酸殘基進行修改。它往往利用點突變的技術，在維持蛋白質原有功能的基礎上，改進某一些性質特點。目前八十八頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點基因定點誘變技術的常用方法是PCR法。突變點：人工合成的引物上手段：PCR技術目的：獲得定點突變的基因位點特異性突變：通過特異地改變編碼核苷酸從而替代蛋白質中的某個氨基酸。可高效、準確地得到蛋白質突變體。但這種方法得到的突變體數(shù)量有限，因此在ＤＮＡ操作技術的帶動下，發(fā)現(xiàn)了隨機突變法。目前八十九頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點

設計速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長因子－I(IGF－I)的結構和性質與胰島素具有高度的同源性和三維結構的相似性，但IGF－I不形成二聚體。IGF－I的B結構域（與胰島素B鏈相對應）中B28－B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28－B29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過臨床實驗。目前九十頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點枯草桿菌堿性蛋白酶(重要工業(yè)用酶)對堿、熱、氧化作用抗力差，易失活。Met/Ala(222),成功地制備出具有耐堿、耐熱以及抗氧化的各種新特性的蛋白酶。

胰蛋白酶（Lys-Arg）易自溶失活對自溶片段分析，對Arg117進行設計，引入缺失突變。穩(wěn)定性大大提高。表面電荷正改負，在較高pH條件下提高了其專一性（Lys-Arg）。目前九十一頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點葡萄糖異構酶（GI）在工業(yè)上應用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標氨基酸后，用雙引物法對GI基因進行體外定點誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質粒在大腸桿菌中表達，結果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應溫度提高10～12℃；酶比活相同

目前九十二頁\總數(shù)一百零一頁\編于十三點中改是對蛋白質分子中某些結構單元或肽段進行分子裁剪，通過基因操作，在不同的蛋白質分子之間替