葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)

葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)第1頁/共21頁一、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液三、用DEAE-纖維素（系Pharmacia

產(chǎn)品）柱層析作第一步提取四、用SephadexG-75分子篩層析柱進(jìn)一步純化五、純化前后SET-C的SDS鑒定六、純化后的SET-C分子量測(cè)定七、對(duì)SET-C純化品的N末端氨基酸測(cè)定第2頁/共21頁前言為了檢測(cè)“金葡素”制劑中有效成份葡萄球菌腸毒素C(SET-C),我們對(duì)提純SET-C方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。經(jīng)多次試驗(yàn)，認(rèn)為按四部法提取SET-C能獲得較好效果，并對(duì)SET-C的某些生物學(xué)特性作了探索?，F(xiàn)總結(jié)如下：第3頁/共21頁一、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選

我們比較了豬心胨湯（原生產(chǎn)“金葡素”用培養(yǎng)基）、酶解豬心湯和胰酪胨綜合培養(yǎng)基，接種復(fù)壯后種子液，以靜置與搖瓶（156r/min）二種方式作48小時(shí)培養(yǎng)，取出以高速離心法除去菌細(xì)胞，再用0.45um微孔濾膜過濾除去殘存菌，取其無菌濾液用反相膠乳凝集試驗(yàn)（RPLA）測(cè)SET-C含量。第4頁/共21頁結(jié)果證明：胰酪胨綜合培養(yǎng)以搖瓶培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，其產(chǎn)生SET-C最高。因此，我們?cè)谧鱏ET-C提純時(shí)就決定采用胰酪胨綜合培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)方式來制備腸毒素原液。第5頁/共21頁二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液

采用中科院上海原子核研究所裝配的POST-FLOTMⅡ型流動(dòng)循環(huán)超濾泵，以10000dalton超濾膜對(duì)腸毒素原液進(jìn)行截留濃縮，除去原液中水份及10000dalton以下的小分子物質(zhì)，使原液濃縮達(dá)20倍以上，離心除沉淀，取其上清，經(jīng)透析作為純化SET-C的原液。第6頁/共21頁三、用DEAE-纖維素（系Pharmacia

產(chǎn)品）柱層析作第一步提取

一般要求DEAE-纖維素40～100目，臨用前過篩，再以蒸餾水漂洗，去除細(xì)微粒子。用1%NaoH和和1%HCL交替處理后直至洗滌液呈中性。再用0.01mol/LPH5.4PB沖洗平衡，裝柱。柱大小為4.1×42cm。裝柱時(shí)切忌氣泡進(jìn)入，裝好柱后用同一PB緩慢洗滌使整個(gè)柱內(nèi)達(dá)到平衡，然后上樣。

第7頁/共21頁即將上一步濃縮透析過的SET-C原液緩慢加入使全部入柱后。先用PH5.00.01mol/LPB洗滌，使有色液體流盡。其后作分管收集，每10分鐘收集一管，其量為7.5ml，對(duì)收集液逐管在OD280nm紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)蛋白峰出現(xiàn)管數(shù)。

第8頁/共21頁其后相繼換用PH6.6、0.06mol/LPB和PH6.8，0.2mol/LPB分步洗脫，洗速為45ml/hr，每管仍用OD280nm紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)洗脫液蛋白吸收峰。并對(duì)各峰洗脫液合并，再用反相膠乳凝集試驗(yàn)（RPLA）檢測(cè)是否有SET-C存在，合并蛋白峰。收集結(jié)果證明SET-C在第Ⅱ峰，結(jié)果見圖1，并對(duì)Ⅱ峰用PEG濃縮至一定量，提供下一步純化。第9頁/共21頁圖1：用DEAE-纖維素層析結(jié)果第10頁/共21頁四、用SephadexG-75分子篩

層析柱進(jìn)一步純化對(duì)收集經(jīng)DEAE-纖維素層析分離的第Ⅱ峰洗脫液合并，用PEG濃縮，將濃縮液置透析袋中，用0.01mol/LPH7.4PB透析平衡后，將第一步濃縮透析液再通過事先準(zhǔn)備好的SephadexG-75分子篩柱(2.6×30cm)過柱。第11頁/共21頁上樣后用0.01mol/LPH7.4PB洗脫，洗脫液出現(xiàn)一個(gè)蛋白峰，用RPLA檢測(cè)毒素即在此峰，收集Ⅰ峰混合，濃縮。結(jié)果見圖2：

圖2：用SephadexG-75分子篩結(jié)果第12頁/共21頁對(duì)截留后濃縮液及通過DEAE纖維素柱層析與SephadexG-75分子篩過柱后各項(xiàng)內(nèi)容的變化情況見表1：

表1：SET-C的提純及回收率

檢測(cè)內(nèi)容項(xiàng)目體積（ml）蛋白量(mg/ml)總蛋白（mg）RPLA(mg/ml)毒素（mg）總回收率(%)純度（%）分子截留后的濃縮液40022.188400.4276.25DEAE纖維素Ⅱ峰10420.72152.84.6180.386646SephadexG-75峰524.18217.369.64138.577696.4

從表1可見，通過DEAE-纖維素柱層析后，SET-C回收率為66%而純度為46%，再通過SephadexG-75分子篩過柱后回收率達(dá)76%，而純度則達(dá)96.4%。第13頁/共21頁五、純化前后SET-C的SDS鑒定

對(duì)分子截留濃縮的截留原液，經(jīng)DEAE-纖維素初步提以的濃縮液及再經(jīng)SephadexG-75分子篩純化后濃縮液，在同一塊10%的SDS凝膠板上，分別滴樣進(jìn)行電泳后染色觀察，結(jié)果見圖3：

第14頁/共21頁C

B

A（A：濃縮液B：經(jīng)DEAE柱C：經(jīng)SephadexG-75柱）圖3SET-C各部樣品的電泳圖譜

從圖3可見，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析后，雜蛋白帶顯著減少，而再經(jīng)SephadexG-75分子篩提純后，在SDS中呈現(xiàn)一條清晰的條帶。第15頁/共21頁六、純化后的SET-C分子量測(cè)定對(duì)純化后的SET-C制品與已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一塊10%SDS凝膠板進(jìn)行電泳后作染色檢定，結(jié)果見圖4、圖5第16頁/共21頁（M:standardproteinS:sample）

圖4SDS測(cè)定腸毒素C分子量圖5SETC分子量測(cè)定結(jié)果30000第17頁/共21頁從圖4、圖5中可見純化SET-C在PAGE中呈現(xiàn)單一條帶，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量比較計(jì)算，SET-C的分子量約在28000dalton左右。第18頁/共21頁七、對(duì)SET-C純化品的N末端氨基酸測(cè)定由我公司提供純化SET-C，請(qǐng)上?；瞪锛夹g(shù)有限公司，用PROCISE(R)cLC蛋白測(cè)序系統(tǒng)（Appl