分子發(fā)光分析法

分子發(fā)光分析法1井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第1頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱(chēng)為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛(ài)的天藍(lán)色。直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光光度計(jì)觀(guān)察到其熒光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)稍微長(zhǎng)些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長(zhǎng)的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”推演而提出“熒光”這一術(shù)語(yǔ)。1867年，Goppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測(cè)定。19世紀(jì)以前，熒光的觀(guān)察是靠肉眼進(jìn)行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺(tái)熒光計(jì)。2井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第2頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的分析方法為分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過(guò)程中以光輻射形式釋放能量3井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第3頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類(lèi)：

光致發(fā)光：以光能來(lái)激發(fā)而發(fā)光

電致發(fā)光：以電能來(lái)激發(fā)而發(fā)光—熒光燈生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法4井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第4頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、熒光與磷光的產(chǎn)生過(guò)程由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1.分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見(jiàn)能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；第一節(jié)分子發(fā)光分析法原理5井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第5頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

6井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第6頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；7井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第7頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫8井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第8頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一非輻射能量傳遞過(guò)程

振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無(wú)輻射能級(jí)交換。通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋—軌道耦合進(jìn)行。9井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第9頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一輻射能量傳遞過(guò)程

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為S1→S0躍遷；10-7～10-9s

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)；磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。10井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第10頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜

熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線(xiàn)

固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線(xiàn)（圖中曲線(xiàn)I）。

激發(fā)光譜曲線(xiàn)的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；11井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第11頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(xiàn)(圖中曲線(xiàn)II或III)。12井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第12頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一13井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第13頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。14井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第14頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似；

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

15井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第15頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜16井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第16頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（）：

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；17井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第17頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類(lèi)型：*→的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。18井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第18頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯19井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第19頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一20井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第20頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、影響熒光強(qiáng)度的因素

影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3.溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；21井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第21頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一pH≈1有熒光pH≈13無(wú)熒光無(wú)熒光有熒光另外，表面活性劑也會(huì)影響熒光強(qiáng)度和特性22井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第22頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。

內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；23井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第23頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.溶液熒光的猝滅——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率f下降稱(chēng)為熒光猝滅。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱(chēng)為熒光猝滅劑氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見(jiàn)的熒光猝滅劑碰撞猝滅——M+激→M*M*+Q→M+Q+熱靜態(tài)猝滅自猝滅——熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。24井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第24頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、儀器結(jié)構(gòu)流程

測(cè)量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角?；玖鞒倘鐖D：?jiǎn)紊鳎哼x擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長(zhǎng)的第二單色器；光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見(jiàn)與紫外區(qū))檢測(cè)器：光電倍增管。第二節(jié)分子熒光與磷光分析法25井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第25頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬熒光光度計(jì)中，常使用鹵鎢燈作光源熒光分光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線(xiàn)以365nm的譜線(xiàn)最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源26井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第26頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2、單色器熒光計(jì)用濾光片作單色器，熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)

ex

，用此激發(fā)光激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)

ex第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來(lái)選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)

em。在選定的

em

下測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析27井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第27頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3、樣品池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊1.樣品池的材料：與紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池兩面透光熒光分光光度計(jì)的樣品池四面透光波長(zhǎng)范圍3.使用注意事項(xiàng)容易破碎問(wèn)題：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么區(qū)別？沾污問(wèn)題28井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第28頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4、檢測(cè)器把光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào),放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度5、讀出裝置記錄儀記錄或打印機(jī)打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜29井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第29頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一儀

器

光

路

圖30井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第30頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一同步掃描技術(shù)

根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差()和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種；

同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；如圖。

合適的可減少光譜重疊；酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。31井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第31頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖32井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第32頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長(zhǎng)需根據(jù)激發(fā)光譜確定——激發(fā)光譜是在固定熒光波長(zhǎng)下，測(cè)量熒光體的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化的光譜Iex固定em熒光波長(zhǎng)獲得方法：先把第二單色器的波長(zhǎng)固定，使測(cè)定的em不變，改變第一單色器波長(zhǎng)，從200~700nm掃描，讓不同波長(zhǎng)的光照在熒光物質(zhì)上，測(cè)定它的熒光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，ex為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜從曲線(xiàn)上找出ex，實(shí)際上選波長(zhǎng)較長(zhǎng)的高波長(zhǎng)峰33井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第33頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Iem固定ex激發(fā)光波長(zhǎng)獲得方法：先把第一單色器的波長(zhǎng)固定，使激發(fā)的ex不變，改變第二單色器波長(zhǎng)，讓不同波長(zhǎng)的光掃描，測(cè)定它的發(fā)光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜從曲線(xiàn)上找出最大的em34井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第34頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一從圖中看出磷＞熒＞

激圖吸收峰熒光峰磷光峰35井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第35頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一A.激發(fā)光譜固定em=620nm(MAX)ex=290nm(MAX)固定發(fā)射波長(zhǎng)掃描激發(fā)波長(zhǎng)熒光激發(fā)光譜與紫外-可見(jiàn)吸收光譜類(lèi)似36井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第36頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)B.發(fā)射光譜(熒光光譜)固定激發(fā)波長(zhǎng)掃描發(fā)射波長(zhǎng)C.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系S04321S14321發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)：分子的激發(fā)光譜可能含有幾個(gè)激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個(gè)發(fā)射帶；即使分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)，由于經(jīng)過(guò)極快的內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫降到S1電子態(tài)的最低振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。1→

41→

31→

21→11

→41

→31

→21

→137井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第37頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.三維熒光光譜IF

∝f(λex、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描激發(fā)波長(zhǎng)38井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第38頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一IF

∝f(λex、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng)39井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第39頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蒽的三維等高線(xiàn)光譜圖40井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第40頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜41井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第41頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一VB1和VB2的三維熒光光譜42井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第42頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一RLSDSTSATSADS散射片三維共振光散射光譜3.三維共振光散射光譜ADSATSTSRLSDS散射片三維共振光散射等高線(xiàn)光譜圖共振光散射瑞利散射固定ex=270nm拉曼光二級(jí)共振光散射三級(jí)共振光散射熒光光譜有用區(qū)間43井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第43頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一磷光檢測(cè)

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。

測(cè)量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開(kāi)。（2）采用脈沖光源和可控檢測(cè)及時(shí)間分辨技術(shù)。室溫測(cè)量時(shí)，不需要杜瓦瓶。44井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第44頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、熒光分析方法與應(yīng)用1、特點(diǎn)（1）靈敏度高分子發(fā)光分析法比吸收光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)檢測(cè)下限：0.1～0.1g/cm-3相對(duì)靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。45井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第45頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2、方法熒光衍生法熒光猝滅法敏化熒光法46井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第46頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3、定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：If=2.3I0lc

=Kc47井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第47頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出濃度；比較法：在線(xiàn)性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；48井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第48頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4、熒光分析法的應(yīng)用(1)無(wú)機(jī)化合物的分析

與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定49井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第49頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一50井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第50頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(2)生物與有機(jī)化合物的分析51井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第51頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、低溫磷光分析法低溫磷光分析是將試樣溶于有機(jī)溶劑中，在液氮（溫度77K）條件下形成剛性玻璃狀物后，測(cè)量磷光.這樣，可減小分子間的碰撞，防止磷光猝滅.所用的溶劑應(yīng)具備下列條件：①易于制備和提純；②能很好的溶解被分析物質(zhì)；③在77K溫度下應(yīng)有足夠的粘度并能形成明凈的剛性玻璃體；④在所研究的光譜區(qū)背景要低，沒(méi)有明顯的光吸收和光發(fā)射現(xiàn)象。三、磷光分析法的應(yīng)用52井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第52頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一低溫磷光分析常用試劑溶劑及組成混合比例（V/V）使用溫度乙醇＋異戊醇＋乙醚（EPA）2＋5＋577K異丙醇＋異戊醇＋乙醚2＋5+577K乙醇＋甲醇＋碘乙（丙）烷16＋4＋177K水＋乙二醇1＋2123K～150KEPA＋氯仿12＋177KEPA+碘甲烷（IEPA）10+177K三乙醇胺純?nèi)軇?93K～213K53井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第53頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

2、室溫磷光分析低溫磷光需要適當(dāng)?shù)牡蜏貤l件，限制了它的應(yīng)用及發(fā)展.室溫磷光分析避免了低溫條件，將試樣固定在濾紙、硅膠、氧化鋁、玻璃纖維、淀粉、溴化鉀等基體上，以增加其剛性，減少三重態(tài)的碰撞猝滅，增強(qiáng)磷光相對(duì)強(qiáng)度。固體基質(zhì)表面室溫磷光分析膠束穩(wěn)定室溫磷光分析敏化室溫磷光分析54井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第54頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

3、室溫磷光分析應(yīng)用（1）稠環(huán)芳烴分析

采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測(cè)定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）（2）農(nóng)藥、生物堿、植物生長(zhǎng)激素的分析煙堿、降煙堿、新煙堿等分析檢測(cè)限0.01g/cm3

（3）藥物分析和臨床分析55井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第55頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一56井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第56頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、基本原理1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光。A+B=C+D*D*→D+h（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)E=170～300kJ/mol；位于可見(jiàn)光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲(chóng)、海洋發(fā)光生物)中，稱(chēng)生物發(fā)光(bioluminescence)。第三節(jié)化學(xué)發(fā)光分析法57井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第57頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一58井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第58頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一59井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第59頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一60井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第60頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt分析物參加反應(yīng)的速率；61井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第61頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對(duì)于發(fā)光試劑小得多，對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：

dc/dt=Kc；K為反應(yīng)速率常數(shù)。定量依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成線(xiàn)性；（2）在一定條件下，曲線(xiàn)下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測(cè)物濃度成線(xiàn)性：62井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第62頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類(lèi)型（1）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm3；b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應(yīng)

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h最大發(fā)射波長(zhǎng)：200nm；靈敏度1ng/cm3；63井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第63頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h發(fā)射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：64井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第64頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一c.乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h最大發(fā)射波長(zhǎng)：435nm；對(duì)O3的特效反應(yīng)；線(xiàn)性響應(yīng)范圍1ng/cm3～1g/cm3；65井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第65頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在富氫火焰中，也存在著很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；a.一氧化氮

NO+H→HNO*HNO

*→HNO+h發(fā)射光譜范圍：660～770nm；最大發(fā)射波長(zhǎng)：680nm；在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O該反應(yīng)十分迅速。此法可用于測(cè)定空氣中NOx的總量，可與GC聯(lián)用，作為氮化合物的檢測(cè)器。66井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第66頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一b.硫化物

揮發(fā)性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（藍(lán)色）：

SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h發(fā)射光譜范圍：350～460nm；最大發(fā)射波長(zhǎng)：384nm；靈敏度：0.2ng/cm3；

發(fā)射光強(qiáng)度與硫化物濃度的平方成正比。67井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第67頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（3）液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理研究較多，在分析中應(yīng)用最多；可測(cè)痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率：0.01～0.05；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過(guò)程：該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)，利用這一現(xiàn)象可測(cè)定這些金屬離子，包括Co，Cu，Ni，Cr，F(xiàn)e，Ag，Au等；某些金屬離子對(duì)此反應(yīng)有抑制效應(yīng)也能實(shí)現(xiàn)對(duì)這些金屬的檢測(cè)，包括Ce，Hf等。68井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第68頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用（1）該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測(cè)定這些金屬離子。可測(cè)痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等；某些金屬離子對(duì)此反應(yīng)有抑制效應(yīng)也能實(shí)現(xiàn)對(duì)這些金屬的檢測(cè)，包括Ce，Hf等。（2）可檢測(cè)低至10-9mol/L的H2O2；（3）間接測(cè)定某些生物試樣

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通過(guò)測(cè)定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶69井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院分析化學(xué)教研室何德勇第69頁(yè)，共77頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

草酸二酯(能量提供體)+