布魯氏菌試管凝集試驗

布魯氏菌試管凝集試驗布魯氏菌試管凝集試驗第1頁

免疫學基礎

布魯氏菌試管凝集試驗第2頁因為布魯氏菌培養(yǎng)營養(yǎng)條件苛刻而且時間長，所以布魯氏菌血清學診療越來越受到重視。布魯氏菌試管凝集試驗第3頁

主要是依據(jù)對應抗原抗體能夠在體外發(fā)生特異性結合并展現(xiàn)可見反應原理,用已知抗原(或抗體)檢測體液中未知抗體(或抗原).因為試驗時通常是用患者血清作為待檢材料,所以檢測抗原抗體體外試驗又稱為血清學試驗或血清學反應.布魯氏菌試管凝集試驗第4頁血清學檢驗既可幫助早期診療，還可確定是否復發(fā)或重復感染。感染1-2周后，患者血清中出現(xiàn)IgM抗體，能夠用凝集試驗或抗人球蛋白試驗檢測．感染３周后，患者血清中出現(xiàn)IgG抗體，能夠用補體結合試驗，熒光抗體或ELISA檢測．布魯氏菌試管凝集試驗第5頁

虎紅平板凝集反應（RBPT）布魯氏菌試管凝集試驗第6頁

原理該試驗又稱為班氏孟加拉紅平板凝集試驗。因為所用抗原是酸性（PH3.6—3.9）帶色抗原，該抗原與被檢血清作用時能抑制血清中IgM類抗體凝集活性、檢驗出抗體是IgG類，所以提升了該項反應特異性。布魯氏菌試管凝集試驗第7頁

器材與試劑虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫脂玻片或有凹形孔玻片、0.1ml吸管或微量加樣器、混合棒或牙簽布魯氏菌試管凝集試驗第8頁

試驗方法在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，在5分鐘內(nèi)觀察結果。布魯氏菌試管凝集試驗第9頁(四)結果判定有二種方法，第一個是，出現(xiàn)可見凝集反應就判為陽性；另一個用“+”表示凝集程度按以下標準用加號統(tǒng)計反應強度：++++：出現(xiàn)大凝聚片或小粒狀物，液體完全透明，100%凝集+++：有顯著凝聚片，液體幾乎完全透明，75%凝集++：有可見凝集片，液體不甚透明，50%凝集+：液體混濁，只有少許粒狀物，25%凝集-：液體均勻混濁布魯氏菌試管凝集試驗第10頁評價此法簡便、快速、輕易操作，適于基層大面積檢疫；此法有一定敏感性，檢驗牛陽性率稍高于綿羊、山羊。因為在酸性環(huán)境下IgM活性受抑，該法主要是檢驗IgG類凝集抗體，所以特異性很好，與補體結合試驗、二巰基乙醇（2-ME）試驗和抗球蛋白（Coomb’s0）試驗有較高吻合率。該法受制備抗原時條件影響較大，所以每批制備抗原應給予檢驗、標化方可應用。布魯氏菌試管凝集試驗第11頁布魯氏菌試管凝集試驗第12頁

試管凝集試驗布魯氏菌試管凝集試驗第13頁試管凝集試驗原理

1897年萊特氏等(Wright)與其同事發(fā)覺患該病病人血清與馬爾他細菌培養(yǎng)物產(chǎn)生了凝集現(xiàn)象，遂稱之為萊特氏凝集反應，成了迄今常見血清學診療方法之一。布魯氏菌試管凝集試驗第14頁設備及試劑試管凝集抗原被檢血清0.5%石碳酸生理鹽水吸管試管試管架孵箱布魯氏菌試管凝集試驗第15頁操作步驟

被檢血清稀釋:普通情況下,每份血清用5支小試管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理鹽水,第二管不加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸管吸收被檢血清0.2毫升,加入第一管中,混勻?；靹蚝?以該吸管吸收第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以該吸管將第三管混勻，并吸收0.5毫升加入第四管,依次稀釋到第五管,混勻后從第五管吸出0.5毫升棄去.如此稀釋后,從第二管起血清稀釋度分別為1:12.51:251:501:100布魯氏菌試管凝集試驗第16頁操作步驟加入抗原:先以0.5%石碳酸生理鹽水將抗原原液做適當稀釋（普通是作1:10稀釋）,稀釋后抗原加入各稀釋血清管（第一管不加，作為血清對照）,每管0.5毫升,混勻。加入抗原后，第二管至第五管每管總量為1毫升，從第二管起血清稀釋度分別為1:251:501:1001:200，從第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。對照管制作:抗原對照（適當稀釋抗原加石碳酸鹽水）被檢血清對照陰性對照（陰性血清稀釋后加抗原）陽性對照（陽性血清稀釋到原有滴度加抗原）布魯氏菌試管凝集試驗第17頁然后將試驗管和對照管充分混勻后，放于37℃溫箱中20-22小時后取出，在室溫下放置2個小時，以比濁管為標準判定結果。布魯氏菌試管凝集試驗第18頁

結果判定判定比濁管制備:每次試驗須配制比濁管作為判定標準依據(jù).配制方法是:取此次試驗用抗原稀釋液（普通1:10）5-10毫升，加入等量0.5%石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下表配制比濁管比濁管配制布魯氏菌試管凝集試驗第19頁

試管凝集反應標準比濁管配制

管號抗原稀釋液（ml）生理鹽水（ml）透明度標識10.001.00100%++++20.250.7575%+++30.500.5050%++40.750.2525%＋51.000.000%－布魯氏菌試管凝集試驗第20頁結果統(tǒng)計依據(jù)各管中上層液體清亮程度統(tǒng)計結果，尤其是50%清亮度（++）對判定結果關系較大，一定要與比濁管對比判定血清對照為清亮透明無沉淀,抗原對照為均勻混濁在兩種對照管都成立情況下，才可判定試驗管，不然應重做。對沉淀需要經(jīng)驗判定。布魯氏菌試管凝集試驗第21頁

“+++”幾乎完全凝集，上清液75%清亮“++”顯著凝集，上清液50%清亮“+”微量凝集，液體25%清亮“-”無凝集，液體不清亮確定每份血清滴度是以出現(xiàn)“++”及以上凝集現(xiàn)象最高血清稀釋度“++++”完全凝集，上清液100%清亮布魯氏菌試管凝集試驗第22頁診療標準沒有進行過菌苗接種人、畜血清試驗標準是：人、牛、馬、鹿、駱駝等大家畜血清為1：100(++)及以上者為陽性，1：50(++)為可疑。豬、羊(綿羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：50(++)及以上者為陽性，1：25(++)為可疑。對可疑反應人和動物應在10-25天內(nèi)重復檢驗，方便深入確定診療。布魯氏菌試管凝集試驗第23頁影響試驗結果原因及注意事項

受檢血清應新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能超出10℃，采血后應于3—4日內(nèi)進行檢驗，因放置時間過長可能會造成血清效價降低。

恪守操作規(guī)程：所用器材要清潔、干燥，試劑加量一定要正確，放入溫箱溫度和時間都要按要求，不然都影響結果。每份血清和抗原均要有對照。高滲鹽水作凝集反應，普通濃度在10~12%，普通切記人血清不能用高滲鹽水。布魯氏菌試管凝集試驗第24頁作凝集反應時，有個別血清會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即稀釋度低血清管內(nèi)(或血清量多格)不發(fā)生凝集，而稀釋度高管內(nèi)(或血清量少格)出現(xiàn)凝集，這叫做前帶現(xiàn)象。假如某血清在平板凝集反應中出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象，那么做試管反應時應多做幾個管，多采取幾個稀釋度。

氯化鈉含量增高對血清反應有顯著影響，鹽濃度越高，反應敏感性提升，所以在獸醫(yī)界為了克服凝集反應中阻抑抗體干擾，對羊血清采取高滲鹽水作凝集反應，普通濃度在10~12%，切記普通人血清不能用高滲鹽水。布魯氏菌試管凝集試驗第25頁

前帶現(xiàn)象產(chǎn)生原因①膠體粒子學說：血清稀釋度低所含膠體粒子多，它影響抗原抗體結合，而稀釋度高則含膠體粒子少，所以出現(xiàn)凝集。②不完全抗體學說：血清中因存在不完全抗體競爭抗原，所以在低稀釋度管中不凝集。③抗原抗體百分比失調，也就是抗體過?；蜓鍍?nèi)含有過多防腐劑，嚴重污染可造成前帶現(xiàn)象產(chǎn)生，封閉抗原干擾。布魯氏菌試管凝集試驗第26頁評價該方法特異性很好，敏感性也高，所以適合用于檢疫和臨床診療。因為該試驗有時出現(xiàn)前帶現(xiàn)象和封閉現(xiàn)象，所以有時也出現(xiàn)假陰性結果，必要時和其它方法聯(lián)合應用。布魯氏菌試管凝集試驗第27頁抗原抗體反應特點布魯氏菌試管凝集試驗第28頁抗原抗體結合特異性

抗原抗體結合基礎是抗原決定簇與抗體抗原結合部位之間反應.這種反應是專一性.比如:布氏桿菌只能與布氏桿菌抗體相結合,而不能與痢疾桿菌抗體相結合.布魯氏菌試管凝集試驗第29頁

抗原抗體結合表面性

抗原抗體結合僅僅是分子表面結合，即使二者結合相當穩(wěn)定，但結合后抗原抗體，其本身結構，生物學活性均未遭到破壞,而且在一定條件下可解離.即抗原抗體結合是可逆,所以,解離抗原抗體復合物方法可用于提取,純化抗原或抗體.布魯氏菌試管凝集試驗第30頁抗原抗體結合適當百分比抗原是多價(分子表面有多個抗原決定簇)，抗體普通是雙價，(分子末端有兩個抗原結合部位)，所以，二者結合就有一個百分比關系問題．只有抗原抗體百分比適當，才能形成較大，輕易觀察復合物．如若百分比不妥,就不能形成較大復合物.所以試驗時要依據(jù)不一樣情況反抗原抗體(甚至二者同時)進行連續(xù)稀釋,方便更加好地提供二者最適百分比.顆粒性抗原,因其分子較大,形成可見凝集物質所需抗體較少,所以試驗時普通把含有抗體血清做連續(xù)稀釋,盡管如此,有時還能在含有較多抗體前列試管中,因二者百分比不妥不展現(xiàn)可見反應,這種現(xiàn)象被稱為前帶現(xiàn)象.

布魯氏菌試管凝集試驗第31頁

抗原抗體結合階段性

抗原抗體結合分為兩個階段

第一階段:特異性結合階段,反應快,只需幾秒或幾分即可完成.但不出現(xiàn)肉眼可見反應.

第二階段:抗原抗體結合可見階段,這一階段反應是可見,反應較慢,常需幾分鐘，幾十分鐘或更久。

布魯氏菌試管凝集試驗第32頁抗原抗體反應影響原因電解質；抗原抗體反應必須有適量電解質參加，不然不出現(xiàn)可見反應，普通拿0.85化鈉溶液做為抗原或抗體稀釋液。溫度：適當提升溫度能夠增多抗原與抗體碰撞機會。促進反應現(xiàn)象加速出現(xiàn)。普通最適溫度范圍在0-56之間。在這個范圍內(nèi)，溫度低，對反應促進作用較小，但生成復合物不易解離。溫度高，對反應促進作用較大，但生成復合物輕易解離。實際工作中，多數(shù)反應在37進行。在試驗過程中，普通在加溫之前，適度振搖抗原抗