質(zhì)粒的提取與鑒定

質(zhì)粒的提取與鑒定第1頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日實驗內(nèi)容提取原理操作步驟計算方法操作步驟質(zhì)粒DNA定量酶切原理酶切步驟酶切電泳原理電泳步驟電泳第2頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日2.質(zhì)粒DNA提取原理3.質(zhì)粒DNA操作步驟4.紫外檢測定量知識5.酶切原理、操作步驟6.瓊脂糖電泳原理及步驟7.凝膠成像系統(tǒng)質(zhì)粒DNA的提取酶切分析質(zhì)粒定量瓊脂糖凝膠電泳實驗流程第3頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日實驗?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法了解紫外吸收法檢測DNA濃度與純度的原理、方法學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳操作第4頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日第二部分質(zhì)粒DNA提取與定量ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA第5頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日獨立于細(xì)菌染色替外，能獨立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子；存在于細(xì)菌，放線菌，真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多．質(zhì)粒（Ｐl(wèi)asmid）定義

第6頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日堿裂解法煮沸裂解羥基磷灰石柱層析法質(zhì)粒DNA釋放法酸酚法等方法

選擇哪一種方法主要取決以下幾個因素：質(zhì)粒的大小大腸桿菌菌株裂解后用于純化的技術(shù)和實驗要求第7頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日分離質(zhì)粒DNA的方法包括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA分離質(zhì)粒DNA三步曲分離質(zhì)粒收集裂解細(xì)菌質(zhì)粒擴增基本步驟

第8頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日基本原理

1、堿裂解法基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異；高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性；當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心形成沉定去除；第9頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日2、離心層析柱基本原理

硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA；去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫；第10頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日☆原理示意圖第11頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、臺式離心機、高壓滅菌鍋（二）材料：含pMD18-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α（三）試劑：

LB培養(yǎng)基（液體、固體）Bioteke質(zhì)粒提取試劑盒（北京百泰克，中國）溶液P1溶液P2溶液P3去蛋白液PE漂洗液WB洗脫液EB儀器材料

第12頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活注意：菌液一定懸浮均勻，不能有結(jié)塊溶液I

第13頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日0.2mol/LNaOH1%SDS作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。注意：時間勿太久，動作要溫柔，輕輕顛倒幾次溶液II

第14頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，Na＋可中和DNA注意：復(fù)性時間不宜過長溶液III

第15頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日菌液離心13000rpm,1min棄上清瞬時離心徹底棄上清加250μl溶液P1旋渦振蕩懸浮沉淀加250μl溶液P2加400μl

溶液P3顛倒數(shù)次放置3-5min離心13000rpm,10min取上700μl加到吸附柱中離心13000rpm,1min棄濾液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min離心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）棄濾液，加入500μl漂洗液WB（10）離心13000rpm,1min棄濾液，加入500μl漂洗液WB（11）離心13000rpm,1min棄濾液（12）空柱離心13000rpm,2min放入一個干凈的離心管中(開蓋放置3min)，在吸附膜的中間加60μl洗脫液EB(放置1min)離心13000rpm,1min（13）-20℃保存?zhèn)溆貌僮鞑襟E

顛倒數(shù)次第16頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

紫外光吸收法原理：1,物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)

2,而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的

3,各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜

因此不同波長的單色光通過溶液時其光的能量就會被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.定量檢測

第17頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日計算方法:因為組成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強吸收峰，所以通過測定260nm的吸收峰即可對DNA進行定量。dsDNA(雙鏈DNA)1A260=50ug/mlssDNA(單鏈DNA)1A260=33ug/mlRNA1A260=40ug/ml定量檢測

第18頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日記錄A260值，通過計算確定DNA濃度，公式如下:質(zhì)粒DNA(g/ml)=50×(A260)×稀釋倍數(shù)

注意:我們接下來要用的eppendorf公司生產(chǎn)的紫外分光光度計,會根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)自動算出質(zhì)粒DNA的最終濃度和Ratio值.

定量檢測

第19頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計核酸的純度（Ratio=A260/A280）Ratio=1.8DNA樣品較純,符合實驗要求Ratio＞1.9RNA污染Ratio＜1.6

蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染定量檢測

第20頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日實驗儀器定量檢測

紫外分光光度計

比色杯

第21頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日數(shù)據(jù)處理測量次數(shù)質(zhì)粒DNA濃度(μg/mL)Ratio值(A260/A280)123平均值定量檢測

第22頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日定量檢測

第23頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日菌體老化堿裂解不充分菌體中無質(zhì)粒溶液使用不當(dāng)請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)可減少菌體用量或增加溶液的用量不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。溶液Ⅱ在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液。問題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？

原因?qū)Σ叱Ｒ妴栴}

第24頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日混有蛋白混有RNA混有基因組DNA不要使用過多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)加入RNaseA室溫放置一段時間加入溶液II和III后防止劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時間不要超過16小時。問題二：質(zhì)粒純度不高，如何解決？

原因?qū)Σ叱Ｒ妴栴}

第25頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日第三部分酶切鑒定DNARestrictionEnzymeDigestion第26頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）是DNA操作過程中所使用的基本工具。特異性地結(jié)合于一段被稱為限制酶識別序列的特殊DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并在此切割雙鏈DNA。分子克隆中常用的為II類限制酶，其識別位點長度為4、5或6個核苷酸的反向重復(fù)序列。限制性內(nèi)切酶

第27頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日限制酶的切割點因酶而異，有的在對稱軸處切割,

產(chǎn)生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ.限制性內(nèi)切酶

第28頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日★平末端

在識別順序的中心對稱軸處切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性內(nèi)切酶

第29頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日★3’端粘性末端

在識別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性內(nèi)切酶

第30頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端

在識別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性內(nèi)切酶

第31頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日雙酶切限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER如果有一種buffer能同時使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer；如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和；限制性內(nèi)切酶

第32頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日Buffer的選擇查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表第33頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

酶量的選擇任何時候2種酶的總量不能超過反應(yīng)體系的1/10體積，而且最大反應(yīng)體系最好不要小于20ul。以TAKARA的為例，其對1單位酶的定義如下：在50μl反應(yīng)液中，30℃溫度下反應(yīng)1小時，將1μg的λDNA完全分解的酶量定義為1個活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的因素外該酶可分解15μg的DNA。限制性內(nèi)切酶

第34頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日插入400bpDNA片段質(zhì)粒大小為:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小為?酶切位點酶切位點第35頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日影響酶切反應(yīng)的因素

底物DNA的純度：主要污染DNA的某些物質(zhì)，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反應(yīng);反應(yīng)系統(tǒng)：主要是反應(yīng)緩沖液中的離子強度,如NaCl和Mg2+,合適離子強度可以激發(fā)酶切反應(yīng);

反應(yīng)體積：一般應(yīng)盡量小，且酶切反應(yīng)中甘油濃度應(yīng)低于5%;保溫時間與溫度：溫度改變會使酶識別錯誤;限制性內(nèi)切酶

第36頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日試劑名稱體積(μL)無菌水6.010×M酶切緩沖液2.0質(zhì)粒DNA10.0HindIII(15U/ul)1.0EcoRI(12U/ul)1.0總體積20.0在一個潔凈的1.5mlEP管中按順序依次加入下述試劑移液槍輕輕混勻(避免產(chǎn)生氣泡),37℃水浴1h反應(yīng)體系

第37頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日第四部分瓊脂糖凝膠電泳DNAAgaroseGelElectrophoresis第38頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose，約占80％）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。

定義

第39頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動.DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系).實驗原理

第40頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日

1、DNA的分子大小

2、瓊脂糖濃度

3、DNA分子的構(gòu)象

4、電源電壓

5、嵌入染料的存在

6、離子強度影響

影響遷移速率因素

第41頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日分離范圍

第42頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日１.電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍呈藍紫色；二甲苯晴呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。

２．Gelview３．TBE４．瓊脂糖5、DNAMarker5000實驗材料

第43頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日溴化乙錠(EB)

:3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，可與DNA結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,有致癌性.Gelview:

是一種新型核酸染料,可與DNA分子形成復(fù)合物，能產(chǎn)生極強的熒光信號，其靈敏度比EB高,且熒光強度與DNA含量成正比熒光,在紫外光照射下呈現(xiàn)綠色熒光.常用染料實驗材料

第44頁，共50頁，2023年，2月20日，星期日是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時，加樣用做對比來檢測瓊脂糖凝膠是否有問題。DNAMarker

應(yīng)選擇在目