基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)專家講座

AndrewZ.Fire

CraigCameronMello

安德魯·法爾和克雷格·梅洛基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第1頁1995年，康乃爾大學(xué)SuGuo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中par-1基因時，發(fā)覺了一個意想不到現(xiàn)象。她們本是利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因表示，而同時在對照試驗中給線蟲注射正義RNA（senseRNA）以期觀察到基因表示增強(qiáng)。但得到結(jié)果是二者都一樣地切斷了par-1基因表示路徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)解釋恰好相反。該研究小組一直沒能給這個意外以合了解釋。直到1998年2月，華盛頓卡耐基研究院AndrewFire和馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院CraigMello才首次揭開這個懸疑之謎。經(jīng)過大量艱辛工作，他們證實，SuGuo博士碰到正義RNA抑制基因表示現(xiàn)象，以及過去反義RNA技術(shù)對基因表示阻斷，都是因為體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引發(fā)。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)覺，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化雙鏈RNA卻恰好相反，能夠高效特異性阻斷對應(yīng)基因表示。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNAinterference,簡稱RNAi)。在隨即短短一年中，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)覺于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化早期階段。伴隨研究不停深入，RNAi機(jī)制正在被逐步說明，而同時作為功效基因組研究領(lǐng)域中有力工具，RNAi也越來越為人們所重視?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第2頁年，RNA研究進(jìn)展被美國《科學(xué)》雜志評為重大科技突破；年“RNA干擾”作為當(dāng)年最主要科學(xué)研究結(jié)果之一，再次入選“十大科技突破”；年12月20日，Science雜志將“SmallRNA&RNAi”評為年度最刺眼明星。同時，Nature雜志亦將SmallRNA評為年度重大科技成功之一。年，小核糖核酸研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近20年來，可與HGP（人類基因組計劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論最重大結(jié)果之一。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第3頁三、基因干預(yù)

GeneInterference基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第4頁基因干預(yù)種類：1.反義RNA(antisenseRNA)2.干擾RNA(RNAinterference)3.核酶(ribozyme)基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第5頁反義RNA:與靶核酸（如mRNA或有義DNA）鏈互補(bǔ)RNA分子，可抑制核酸功效反義RNA，依據(jù)反義RNA作用機(jī)制可將其分為3類：Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNASD序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ類反義RNA與mRNA非編碼區(qū)結(jié)合，引發(fā)mRNA構(gòu)象改變，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第6頁

（一）反義RNA1.反義RNA與基因表示調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行基因表示調(diào)控，通常采取方法有兩種：（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第7頁

反義RNA關(guān)鍵技術(shù)問題：?反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前降解問題?專一性轉(zhuǎn)移問題：

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第8頁2.受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)

①受體介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移RNA是被保護(hù)，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸保護(hù)層,能夠抵抗環(huán)境中核酸酶降解作用。

將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運載核酸工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物能夠?qū)Ｒ恍缘乇桓渭?xì)胞表面ASGP受體所識別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐步釋放出來發(fā)揮作用。

借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就能夠?qū)崿F(xiàn)受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第9頁

3.反義RNA應(yīng)用前景

受體介導(dǎo)反義RNA基因治療有其本身優(yōu)點，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療不足。

（l）安全性高（2）反義RNA設(shè)計和制備方便

（3）含有劑量調(diào)整效應(yīng)

（4）能直接作用于一些RNA病毒反義RNA只作用于特異mRNA分子，不改變所調(diào)整基因結(jié)構(gòu)。反義RNA分子不論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留“殘渣”。

在治療RNA病毒感染性疾病時，受體介導(dǎo)反義RNA基因治療比普通DNA基因治療有更大優(yōu)勢。利用反義RNA能夠直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒繁殖?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第10頁（二）干擾RNA

試驗結(jié)果顯示，有義鏈RNA（senseRNA）或反義鏈RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因表示，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列基因表示。得到結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都一樣阻斷基因表示路徑。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)解釋恰好相反。而且其抑制基因表示效率比反義RNA最少高2個數(shù)量級。1.RNA干擾現(xiàn)象

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一個由雙鏈RNA誘發(fā)基因緘默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因表示。對RNA干擾認(rèn)識起源于用線蟲（C.elegans）和果蠅所進(jìn)行試驗。/nrg/journal/v2/n2/animation/nrg0201_110a_swf_MEDIA1.html/RNAi.htm基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第11頁

2.RNA干擾機(jī)制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。該復(fù)合體可識別與siRNA有同源序列mRNA，并在特異位點將該mRNA切斷。長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基正確短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第12頁A.賈第鞭毛蟲Dicer晶體結(jié)構(gòu)；RNA干擾機(jī)制示意圖

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第13頁

1.體外化學(xué)合成;

2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA產(chǎn)生基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第14頁3.RNA干擾應(yīng)用前景RNA干擾研究當(dāng)前已經(jīng)在功效基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目標(biāo)進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用有著遼闊前景。基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第15頁（1）研究基因功效新工具

因為RNA干擾技術(shù)含有高度序列專一性和有效干擾能力，能夠使特定基因緘默或功效喪失，所以能夠作為功效基因組學(xué)一個強(qiáng)有力研究工具。

RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因表示，建立各種表型；抑制基因表示時間能夠控制在發(fā)育任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除效應(yīng)。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第16頁

（2）腫瘤基因治療

傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)單一癌基因阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤生長，而RNA干擾技術(shù)能夠利用同一基因家族多個基因含有一段同源性很高保守序列這一特征，設(shè)計針對這一區(qū)段序列雙鏈RNA分子，只使用一個雙鏈RNA即能夠產(chǎn)生多個基因同時剔除表型，也能夠同時使用各種雙鏈RNA而將多個序列不相關(guān)基因同時剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異常基因表示惡性腫瘤。

K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病相關(guān)，用RNA干擾技術(shù)能夠妨礙K-RAS蛋白表示從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1人白血病細(xì)胞系。經(jīng)過RNA干擾抑制一些內(nèi)源性基因表示，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系細(xì)胞凋亡或增加其對化療藥品反應(yīng)性。

應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細(xì)胞中一個異常表示與細(xì)胞增殖分化相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp1功效?！熬}默”真是金

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第17頁

（3）病毒性疾病基因治療

RNA干擾能夠被看成是一個與免疫系統(tǒng)類似防御機(jī)制。用siRNA抑制人類免疫缺點病毒（HIV）一些基因表示，如P24、Vif、nef、tat或rev，妨礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用RNA干擾技術(shù)抑制HIV受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表示，可妨礙HIV感染細(xì)胞。也可經(jīng)過RNA干擾抑制其它病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。“緘默”真是金基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第18頁

siRNA在病毒感染早期階段能有效地抑制病毒復(fù)制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因siRNA所阻斷，RNA干擾技術(shù)將成為一個有效抗病毒治療伎倆。這對于許多嚴(yán)重病毒性疾病防治含有十分重大意義?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第19頁siRNA輸送（siRNAdelivery)基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第20頁siRNA輸送（siRNAdelivery)基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第21頁T.Cech

S.Altman

1989年，核酶發(fā)覺者T.Cech和S.Altman被授予諾貝爾化學(xué)獎。

（三）核酶(ribozyme)

核酶（ribozyme）是含有催化功效RNA分子

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第22頁（三）核酶(ribozyme)

天然核酶多為單一RNA分子，含有自我剪切作用。但核酶也能夠由兩個RNA分子組成。在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)鄰位，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，經(jīng)過破壞靶RNA分子到達(dá)治療疾?。ㄈ缛コ《净蚪MRNA）目標(biāo)。只要兩個RNA分子經(jīng)過互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶關(guān)鍵序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第23頁

1.核酶設(shè)計核酶是經(jīng)過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶。

（1）選擇適當(dāng)靶部位，該部位含有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶基本組成：用于基因治療核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。在基因治療中，主要是依據(jù)治療靶基因序列特點，設(shè)計和合成特定核酶。設(shè)計基本標(biāo)準(zhǔn)是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第24頁核酶作用機(jī)制

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第25頁

2.核酶應(yīng)用

與普通反義RNA相比，核酶含有較穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶攻擊。更主要是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它mRNA分子。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第26頁四、治療基因受控表示

RegulatedExpressionofTherapeuticGene基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第27頁時間:要實現(xiàn)治療基因受控表示，必須建立完善基因表示調(diào)控體系。基因調(diào)控策略大致有以下幾個：基因內(nèi)部調(diào)整機(jī)制、基因外部調(diào)整機(jī)制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表示以及治療基因誘導(dǎo)表示等。

治療基因受控表示包含控制治療基因表示時間、空間和水平三個方面。

空間:表示水平：希望治療基因能在一個適當(dāng)水平表示。

1.控制治療基因在患者需要實施治療時才表示，而平時不需要進(jìn)行治療時則處于關(guān)閉狀態(tài)；2.依據(jù)不一樣疾病治療要求，控制治療基因連續(xù)表示時間跨度。是指為了提升基因治療專一性和安全性，嚴(yán)格限制治療基因只在靶細(xì)胞中表示，防止治療基因指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)干擾非靶細(xì)胞正常生活，產(chǎn)生毒副作用?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第28頁（一）基因內(nèi)部調(diào)整機(jī)制?使用正常細(xì)胞組織特異性開啟子、增強(qiáng)子元件?使用病變細(xì)胞組織特異性開啟子、增強(qiáng)子元件基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第29頁

1.使用正常細(xì)胞組織特異性開啟子、增強(qiáng)子元件

比如，酪氨酸酶是皮膚細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生色素路徑中一個酶，可利用其開啟子驅(qū)動治療基因只在黑色素瘤細(xì)胞中表示，而不在正常周圍細(xì)胞中表示。不一樣類型正常細(xì)胞或組織中往往存在一些特有蛋白質(zhì)，它們基因表示調(diào)控元件可用于驅(qū)動治療基因特異性表示，從而起到治療作用。前列腺特異性抗原(PSA)是參加精液凝塊中蛋白質(zhì)降解、使精液液化一個絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產(chǎn)生，而在前列腺癌細(xì)胞中含量很高，能夠利用PSA基因調(diào)控元件驅(qū)動治療基因在PSA陽性前列腺癌細(xì)胞中表示而發(fā)揮作用，而其在PSA陰性細(xì)胞和非前列腺癌細(xì)胞中不能使治療基因表示?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第30頁

2.使用病變細(xì)胞組織特異性開啟子、增強(qiáng)子元件

一些病變細(xì)胞或組織產(chǎn)生一些特殊蛋白質(zhì)，其基因表示調(diào)整元件也能夠用來控制治療基因特異性表示。甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細(xì)胞中表示，不在成年肝臟細(xì)胞中表示。肝細(xì)胞腺癌細(xì)胞中AFP基因異常激活，所以可利用該基因開啟子驅(qū)動治療基因(如自殺基因)在癌細(xì)胞中表示，使癌細(xì)胞經(jīng)給藥后被殺死。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族組員，在許多腺癌細(xì)胞中表示很高，采取其開啟子能夠使治療基因只在CEA陽性癌細(xì)胞中表示，而不會在陰性細(xì)胞中表示?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第31頁（二）基因外部調(diào)整機(jī)制

除利用基因內(nèi)部調(diào)整機(jī)制以外，還可經(jīng)過施加外部刺激，促進(jìn)治療基因在特定細(xì)胞或組織中表示。采取熱休克蛋白基因表示調(diào)控元件來開啟治療基因，能夠經(jīng)過對病灶局部進(jìn)行熱處理，到達(dá)使治療基因特異性表示目標(biāo)。Egr-1基因是一個編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子早期基因，包含電離輻射和細(xì)胞因子等在內(nèi)各種外部刺激都能夠誘導(dǎo)其表示，將其調(diào)控序列開啟治療基因(如腫瘤壞死因子基因)導(dǎo)入腫瘤組織，可在電離輻射等作用下，使治療基因取得暫時性局部表示，殺死腫瘤細(xì)胞。組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓藥劑，在中風(fēng)和心肌梗死等疾病治療中起著主要作用。t-PA活性在輻射后增加50倍，表明其基因表示調(diào)控元件中存在受輻射誘導(dǎo)調(diào)控元件，故可利用其調(diào)控元件開啟治療基因表示，增強(qiáng)放療效果?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第32頁（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表示

病灶微環(huán)境與正常時往往不一樣，所以可利用這些改變控制治療基因表示。

比如，在腫瘤病灶處，經(jīng)常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)整蛋白GRP78/Bip含量也隨之增加，使癌細(xì)胞能夠抵抗應(yīng)激。當(dāng)采取這種基因開啟子來控制治療基因時，能夠使治療基因在腫瘤細(xì)胞中表示，使腫瘤組織壞死。

腫瘤細(xì)胞生長速度快于形成血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成供血不足，所以在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營養(yǎng)缺乏區(qū)域。缺氧條件能夠經(jīng)過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和缺氧響應(yīng)元件(HRE)相互作用，調(diào)整一些基因表示；假如采取缺氧響應(yīng)元件(HRE)來控制治療基因表示，即可實現(xiàn)治療基因只在缺氧腫瘤組織中表示，而在正常組織中不表示。

機(jī)體發(fā)炎時所可產(chǎn)生許多急性期蛋白，其基因開啟子能夠控制發(fā)炎條件下治療基因表示；而一旦炎癥消失，治療基因表示也隨之終止?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第33頁（四）治療基因誘導(dǎo)表示

采取組織特異性開啟子控制治療基因表示，可能造成這些基因在靶細(xì)胞中表示，不再受外界控制。為了防止這種情況發(fā)生，研究人員正在開發(fā)和完善一些可誘導(dǎo)性基因表示系統(tǒng)。這種系統(tǒng)必要成份：一個是轉(zhuǎn)錄激活劑，它只在誘導(dǎo)藥品存在時才能與DNA結(jié)合；另一個則是特異性基因表示調(diào)控元件，僅對這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應(yīng)。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第34頁四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)素抗性基因轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白負(fù)調(diào)控。無四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因表示；四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素含有極高親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第35頁五、基因治療應(yīng)用研究TheApplicationofGeneTherapy基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第36頁

世界上第一個正式被同意用于基因治療病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常人ADA基因植入ADA缺乏癥病人淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第37頁（一）遺傳病基因治療研究

已知人類有4000各種遺傳病，在人群中發(fā)病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診療僅限于那些為數(shù)不多常見遺傳病。

1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因表示不需要準(zhǔn)確調(diào)控；4.該基因能在一個便于臨床操作組織細(xì)胞(如皮膚細(xì)胞，骨髓細(xì)胞等)中表示并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求不過只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第38頁1．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其它血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其它先天性代謝缺點病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第39頁（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）經(jīng)過基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入各種抑癌基因以抑制癌癥發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；腫瘤發(fā)生是一個極為復(fù)雜過程，許多基因突變會造成腫瘤發(fā)生。（2）抑制癌基因活性，經(jīng)過干擾癌基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性，經(jīng)過對腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞溶解和排斥反應(yīng)；（4）經(jīng)過導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細(xì)胞?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第40頁

1.腫瘤基因治療基本策略

從實際應(yīng)用于臨床治療角度來看，腫瘤基因治療策略包含：(1)直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制其生長。(2)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。(3)改進(jìn)腫瘤常規(guī)治療方法，提升療效。基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第41頁

2.腫瘤基因治療慣用方法

?基因干預(yù)技術(shù)：經(jīng)過基因干預(yù)，使得腫瘤細(xì)胞過分表示癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。

?自殺基因治療—分子化療：直接殺死腫瘤細(xì)胞。

?腫瘤免疫基因治療：以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提升免疫效應(yīng)細(xì)胞功效。

?提升化療效果輔助基因治療：藥品增敏基因治療；耐藥基因治療。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第42頁

3.自殺基因治療：自殺基因治療是當(dāng)前腫瘤基因治療領(lǐng)域中研究熱點之一。

基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入一些真核細(xì)胞中不存在酶基因（自殺基因），這些基因表示特異性酶能夠催化對真核細(xì)胞無毒或低毒藥品前體，轉(zhuǎn)變?yōu)楹幸种坪怂岷铣尚?yīng)抗代謝藥品，進(jìn)而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因腫瘤細(xì)胞“自殺”。這些基因也對應(yīng)地被稱為“自殺基因”?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第43頁自殺基因治療前提條件是“自殺基因”表示必須局限于腫瘤細(xì)胞中，而不傷及正常細(xì)胞。

①利用免疫脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)等技術(shù)進(jìn)行定向基因轉(zhuǎn)移。②利用病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。③腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。④腫瘤內(nèi)直接注射。

自殺基因轉(zhuǎn)移慣用方法基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第44頁4.腫瘤免疫基因治療激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提升免疫效應(yīng)細(xì)胞功效為目標(biāo)一個腫瘤基因治療方法。主要包含細(xì)胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第45頁5.提升化療效果輔助基因治療：

臨床上對腫瘤患者進(jìn)行化療時，通常面臨兩大難題：（1）是患者機(jī)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞對化療藥品敏感程度存在差異，尤其是一些經(jīng)過屢次化療患者，其體內(nèi)腫瘤細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對各種化療藥品產(chǎn)生交差耐受，最終造成化療失敗。（2）是大劑量化療可能造成患者正常細(xì)胞，尤其是骨髓造血細(xì)胞功效受到抑制。

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(1)藥品增敏基因治療：

將雞鈣調(diào)素（calmodulin,CaM）基因?qū)胄∈笕橄侔┘?xì)胞株C127，結(jié)果僅需低劑量長春新堿或長春花堿即可顯著抑制該細(xì)胞株生長。對其作用原理進(jìn)行研究后發(fā)覺，CaM基因表示產(chǎn)物作為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)主要物質(zhì)，顯著增加了腫瘤細(xì)胞對長春新堿或長春花堿吸收量而對應(yīng)降低了排出量，從而提升了腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥品濃度，造成腫瘤細(xì)胞死亡。為了使化療藥品能夠最大程度地殺死腫瘤細(xì)胞，能夠考慮將一些藥品增敏基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，尤其是對化療藥品原本不敏感腫瘤細(xì)胞，使其反抗腫瘤藥品敏感性大大增加，從而到達(dá)增強(qiáng)化療效果目標(biāo)。

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(2)耐藥基因治療：在處理化療所致骨髓細(xì)胞造血功效受到嚴(yán)重抑制問題方面，經(jīng)過向腫瘤患者骨髓細(xì)胞導(dǎo)入某種耐藥基因，如mdr-1基因等，以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞抗藥性，方便耐受大劑量化療藥品，以到達(dá)徹底殺滅腫瘤細(xì)胞目標(biāo)。腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生與各種糖蛋白或酶相關(guān)，包含多藥耐藥（mdr-1）基因編碼P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）以及近年來發(fā)覺肺耐藥相關(guān)蛋白等；還有細(xì)胞內(nèi)氧化和解毒作用酶系統(tǒng)，包含細(xì)胞色素P-450（cytochromeP-450）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等等。當(dāng)前除了開發(fā)針對腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生機(jī)制拮抗劑，如用于阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥戊脈安（verapamil）和用于阻斷GSH合成丁硫氨酸亞砜胺（BSO）等。還采取基因干擾技術(shù)，在基因水平阻斷耐藥基因表示，使腫瘤細(xì)胞喪失多藥耐藥性，從而易于被化療藥品殺死。

基因治療醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)第48頁（三）病毒性疾病基因治療研究據(jù)統(tǒng)計，75%人類傳染病是由病毒引發(fā)。病毒感染人體后不但可能急性發(fā)病，還能夠在人體內(nèi)長久潛伏，造成終生傷害。病毒還是造成先天畸形主要原因之一。研究表明，它與一些癌癥、本身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病也存在一定聯(lián)絡(luò)。迄今為止，臨床上對絕大多