指紋圖譜標記

指紋圖譜標記第1頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六匯報的主要內容1.研究的目的及意義2.研究材料與方法3.結果分析4.討論第2頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六1.目的及意義目的：利用SRAP和ISSR分子標記法構建石竹屬DNA指紋圖譜意義：此圖譜的構建，一方面，為今后石竹屬種間鑒定提供快速、科學的參照標準。另一方面，也為香石竹（康乃馨）雜交育種提供親緣關系的遺傳背景材料。第3頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六2.研究材料與方法研究材料：從新疆烏魯木齊、木壘、霍城、尼勒克、唐布拉、阿爾泰、布爾津、小東溝、廟兒溝等地采集野生石竹的種子，共計10個種。研究方法：DNA提取與純化，PCR反應正交設計，電泳檢測和指紋圖譜構建第4頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六DNA的提取與純化采用改進的CTAB裂解-硅珠吸附法從新鮮的葉片中提取總DNA第5頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六PCR反應的正交設計SRAP-PCR反應：針對影響PCR反應Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶4個因素，選用L9(34)在3水平上進行實驗。使用的引物組合為Me6/Em1。L9(34)設計表見表:組合編號Mg2+(mmol/L)引物(μmol/L)Taq酶（U/L）dNTP（mmol/L）1234567891.51.51.52.02.02.02.52.52.50.150.250.350.150.250.350.150.250.350.51.01.51.01.50.51.50.51.00.150.200.250.250.150.200.200.250.15第6頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六ISSR-PCR反應：針對影響PCR反應Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶4個因素，選用L9(34)在3水平上進行實驗。使用的引物編號為855。L9(34)設計表見表:組合編號Mg2+(mmol/L)引物(μmol/L)Taq酶（U/L）dNTP（mmol/L）1234567891.251.251.251.751.751.752.252.252.250.40.60.80.40.60.80.40.60.80.51.01.51.01.50.51.50.51.00.3250.3750.4250.4250.3250.3750.3750.4250.325第7頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六電泳檢測ISSR瓊脂糖凝膠檢測SRAP聚丙烯酰胺凝膠檢測第8頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六指紋圖譜的構建位點統(tǒng)計法：根據(jù)每對引物生成帶型間的差別直接對帶型進行分類編號，可得到每個種的帶型編號。一個種的DNA經(jīng)過不同引物擴增后，將獲得一系列帶型編號，按照固定的引物序列，串聯(lián)各帶型編號,形成一組數(shù)據(jù)。將這些圖譜轉換為由1和0組成的字串，構成數(shù)字指紋圖譜。第9頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六3.結果分析正交實驗結果與分析指紋圖譜的構建第10頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六正交實驗結果與分析SRAP-PCR反應：選取Me6/Em1作為擴增引物，以同一個種不同家系的4個DNA進行擴增，電泳圖如圖：M123456789第11頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六根據(jù)電泳圖，經(jīng)過極差分析可知：SRAP-PCR反應中，對反應影響最大的是Mg2+,引物，之后dNTP,最后是Taq酶。4個組分的最佳反應水平為：Mg2+2.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.25μmol/L、Taq酶為1.0U。第12頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六ISSR反應：選取855作為擴增引物，以同一個種不同家系的4個DNA進行擴增，電泳圖如圖：M123456789第13頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六根據(jù)電泳圖，經(jīng)過極差分析可知：ISSR-PCR反應中，對反應影響最大的是Mg2+、dNTP、之后是引物，最后是Taq酶。最佳水平為：Mg2+1.25mmol/L、dNTP0.425mmol/L、引物0.8μmol/L、Taq酶為0.5U。第14頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六指紋圖譜構建SRAP數(shù)字指紋圖譜材料編號Me3/Em12Me3/Em14Me8/Em14Me8/Em912345678910100110100100110011001001110010011000110100011000001100101001010010100111111001101101000001100110000001000001110000000100010001001001011110000101000011100001111001111011000100011101101010110110011111100110101000100001011100010100000011011100101001110101101001111001000001第15頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六ISSR數(shù)字指紋圖譜材料編號82684286487882712345678910010101000100000100011001010010110000010000010000000100010001100111111010101001111010000110110010101101111010110011010110110101001010000101000010110100000110100010111000100000100000100010010101000000000100011100001101110010111001100111111000100011000111000001100101101001001000001000100011110111010110100110010111010110010010001100第16頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六4.討論分子標記的體系優(yōu)化：利用正交驗直觀分析方法，能迅速獲得滿意的試驗結果，而且具有試驗規(guī)模小，節(jié)省人力物力的優(yōu)點。但該方法亦有一定的局限性，如對試驗結果本身優(yōu)