雙水相萃取的應(yīng)用

雙水相萃取在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)(Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由于被分離物在兩相中分配的不同,便可實現(xiàn)分離；其雙水相體系可由高聚物/高聚物雙水相體系、高聚物/無機鹽雙水相體系、低分子有機物/無機鹽雙水相體系、表面活性劑雙水相體系等組成，被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。同時，雙水相萃取技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)日益受到重視；此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,收率較高【1】。1、近年來雙水相萃取技術(shù)研究綜述概述由于雙水相萃取技術(shù)在生物工程、醫(yī)藥分析、金屬及一些煤礦等化學(xué)分析中具有重要作用,因此也一直是分離提純領(lǐng)域研究的熱點。特別是在近幾年，隨著生物工程技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、高分子技術(shù)的發(fā)展，雙水相萃取技術(shù)的研究也取得了較快的發(fā)展。2008年，郭憲厚【2】對雙水相萃取技術(shù)進(jìn)行了綜述,闡述了雙水相萃取技術(shù)的基本原理、特點、工藝流程、物質(zhì)分配平衡的影響因素及其在生命科學(xué)，復(fù)雜中藥體系的分離以及重金屬回收等方面的應(yīng)用，并對雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展前景作了展望。2009年，徐長波、王巍杰【3】對雙水相萃取技術(shù)進(jìn)行了綜述，并發(fā)表了《雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展》，以此綜述了雙水相萃取技術(shù)基本原理、特點、應(yīng)用及熱力學(xué)模型,并對雙水相萃取技術(shù)存在的問題和發(fā)展趨勢作了論述。2010年，馬春宏、朱紅【4】等，發(fā)表了《雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展》，對雙水相萃取技術(shù)的具體應(yīng)用進(jìn)行了相關(guān)綜述，簡單介紹了雙水相萃取技術(shù)及其原理、特點,綜述了雙水相體系在生物工程(其中包括萃取分離抗生素、酶、分離提純蛋白質(zhì)和萃取其他生物活性物質(zhì))、藥物分析和金屬分離等方面的應(yīng)用。2010年，姜大雨、朱紅【5】對離子液體雙水相萃取的應(yīng)用研究進(jìn)行了綜述，指出了離子液體雙水相的研究取得的一些階段性的成果，介紹了離子液體雙水相體系及其優(yōu)點,綜述了離子液體雙水相體系在生物工業(yè)分析、藥物分析和金屬分離等方面的應(yīng)用，同時展望了離子液體雙水相體系的應(yīng)用前景。2010年，譚志堅、李芬芳、邢建敏【6】，發(fā)表了《雙水相萃取技術(shù)在分離、純化中的應(yīng)用》對對雙水相萃取技術(shù)的相關(guān)具體應(yīng)用細(xì)節(jié)進(jìn)行了較為詳細(xì)的論述，綜述了雙水相形成原理、工藝流程和特點、體系類別、影響雙水相分配的因素及其在分離純化中的應(yīng)用。2011年，劉云【7】對雙水相萃取技術(shù)的國內(nèi)研究和工業(yè)應(yīng)用做了相關(guān)的綜述，也對其進(jìn)行了系統(tǒng)的概括。2、近年來雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用概述近年來，隨著雙水相萃取技術(shù)理論研究的不斷深入，其在科研中的實際應(yīng)用也不斷擴展，涉及到了生物工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程等多個領(lǐng)域，以及蛋白質(zhì)、酶、糖類及其他一些生物化學(xué)物質(zhì)。2009年，徐長波、王巍杰【8】，用雙水相萃取技術(shù)從鈍頂螺旋藻中分離純化藻藍(lán)蛋白(C-Phycocyanin,C-PC)；采用雙水相體系直接從C-PC粗提液中分離純化C-PC,研究了雙水相的類型、成相鹽的種類、聚合物的平均分子量和濃度、成相鹽的濃度、體系pH以及中性鹽的類型和濃度對C-PC分配影響，確定了分離純化C-PC的雙水相類型為聚合物/鹽系統(tǒng)。2009年，董樹國、賴紅偉、陸釗⑼，發(fā)表了《雙水相萃取在黃酮類化合物分離分析中的應(yīng)用》，對雙水相萃取技術(shù)在黃酮類化合物分離分析中的應(yīng)用進(jìn)行了具體的論述。2009年，李敏、董慧茹【10】在《雙水相萃取-高效液相色譜法測定酵母細(xì)胞中麥角固醇含量》中詳細(xì)介紹了乙醇-水雙水相萃取-高效液相色譜法測定酵母細(xì)胞中麥角固醇含量的分析方法。2008年，張亞杰，夏杰，陸兵等【11】采用雙水相萃取與疏水層析分離純化重組巴氏畢赤酵母表達(dá)的基因工程人溶菌酶。結(jié)果表明：當(dāng)雙水相萃取的pH為4,硫酸鈉、氯化鈉、PEG4000的質(zhì)量濃度為0.13、0.06和0.08時,人溶菌酶上相回收率達(dá)98.8%,純化因子18.0,濃縮因子3.6。雙水相萃取技術(shù)與傳統(tǒng)分離萃取技術(shù)相比的優(yōu)缺點與傳統(tǒng)的萃取及其他分離技術(shù)相比，雙水相萃取對生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物、抗生素等的分離、提取、純化表現(xiàn)出以下優(yōu)勢：整個體系含水量高(70％--90％)，萃取是在接近生理環(huán)境的體系中進(jìn)行，不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性；可以直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需的蛋白質(zhì)(或者酶)，還能不經(jīng)過破碎直接提取細(xì)胞內(nèi)酶，省略了破碎或過濾等步驟；傳質(zhì)速率快，分相時間短。雙水相體系中，含水量高，界面張力小，故傳質(zhì)和平衡速率較快；不存在有機溶劑殘留問題，高聚物一般是不揮發(fā)物質(zhì)，對人體無害；單級分離提純效率高。通過選擇適當(dāng)?shù)碾p水相體系，一般可獲得較大的分配系數(shù)，也可調(diào)節(jié)被分離組分在兩相中的分配系數(shù)，使目標(biāo)產(chǎn)物有較高收率。處理量大，能耗低，易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接，無需進(jìn)行特殊處理；操作條件溫和，所需設(shè)備簡單，整個操作過程在常溫常壓下進(jìn)行；大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去，簡化分離操作過程；分配過程因素較多，可以采取多種手段來提高分配選擇性或過程收率。正是這些優(yōu)勢使ATPE能廣泛應(yīng)用于生物工程、藥物分析和金屬分離等方面。特別是近年來離子液體雙水相萃取技術(shù)作為一種高效而溫和的新型綠色分離體系,離子液體雙水相體系結(jié)合離子液體和雙水相萃取的優(yōu)點，萃取過程中在保持生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等方面有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。但是雙水相萃取技術(shù)自身也存在一些不足之處,如易乳化,相分離時間較長,分離效率不高等,一定程度制約了雙水相技術(shù)的工業(yè)化推廣與應(yīng)用。雙水相萃取技術(shù)機理4.1雙水相系統(tǒng)的形成機理將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混合時，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值，體系會自然的分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系【4】，雙水相體系的形成主要是由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。與一般的水-有機溶劑體系相比較，雙水相體系中兩相的性質(zhì)差別(如密度和折射率等)較小。由于折射率的差別甚小，有時甚至都難于發(fā)現(xiàn)它們的相界面。兩相間的界面張力也很小，僅為10-6?10-4N?m-i(—般體系為10-3?10-2N?m-i)。界面與試管壁形成的接觸角幾乎是直角【2】。4.2雙水相中影響蛋白質(zhì)分配的因素1．聚合物分子量：同一類聚合物的疏水性隨分子量的增大而增強，當(dāng)聚合物的分子量減小時，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。如在PEpDextran系統(tǒng)中，PEG的分子量減小或Dextran的分子量增大都會使分配系數(shù)變大，相反PEG的分子量增大或Dextran的分子量減小會使分配系數(shù)變小。王旭等將PEG400、PEG600、PEG1000分別配成質(zhì)量百分濃度為30%的溶液,PEG1000的溶液中酶活活性比最大，說明其對果膠酶活性的影響最小【⑵。Vaidya等也認(rèn)為小分子量的PEG不適合分離蛋白質(zhì)。PEG相對分子量為2000時，雖然PF及Y值略有減小，但是Kp較小，僅為3.9。中性鹽：在雙水相體系中加入電解質(zhì)，由陰、陽離子在兩相中的分配差異，形成穿過相界面的電位，從而影響帶電大分子物質(zhì)在兩相中的分配，強化分配效率，通常選擇NaCl作電解質(zhì)。張?zhí)m威等加入不同濃度NaCl,通過其分相參數(shù)研究電解質(zhì)對蛋白酶純化的影響，結(jié)果添加NaCl對蛋白酶的分離無強化作用，相反不添加NaCl的體系各項指標(biāo)都較好，故確定不添加NaCl的雙水相體系［18］。焦慶才用PEG/(NH)SO體系分離發(fā)酵液中a2淀粉酶和蛋白酶時也得到同樣結(jié)果。424荷電PEG作為成相聚合物：在聚合物上引入電荷可以增大兩相間的電位差故可在PEG或葡聚糖上引入帶電基團來改變蛋白質(zhì)的分配。因相間電位差與電荷數(shù)成反比，而每個葡聚糖分子上可引入的帶電基團較多，故效果較差。相反，每個PEG分子只含兩個羥基，只需引入兩個荷電基團，電場增大的效果就較好。PH值：體系PH值會影響蛋白質(zhì)分子可離解基團的離解度，從而改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)來影響分配。同時PH值還會影響緩沖離子如HPO2-、PO3-等的分44配，以改變相間電位來達(dá)到改變分配系數(shù)的目的。另外在研究分配系數(shù)與PH值的關(guān)系時，若加入不同種類的中性鹽，由于電位差的不同，其相應(yīng)關(guān)系也不同。楊輝等研究表明果膠酶的分配系數(shù)K值隨PH值的增加先是增加達(dá)到最大值后逐漸下降，當(dāng)PH增加到5.0時，果膠酶在PEG/(NH)SO雙水相系統(tǒng)中有最大的42 4分配系數(shù)K=11.40。有機溶劑：在雙水相體系中添加少量有機共溶劑，使得體系中的一部分水被有機共溶劑所取代，導(dǎo)致兩相界面處的疏水性能差異發(fā)生變化，同時界面張力以及電位差也隨之改變，從而影響了蛋白質(zhì)的分配。通常認(rèn)為，有機共溶劑對被分配物質(zhì)分配行為的影響更主要是有機溶劑和成相高聚物相互作用的結(jié)果。表面活性劑:Bodhankar和Gaikar等研究了四類表面活性劑，即陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑和兩性表面活性劑在PEG-Dextran體系中對物質(zhì)分配的影響。實驗表明，添加表面活性劑可以改變界面張力、上下相組成等兩相特性，從而對物質(zhì)的分配行為進(jìn)行調(diào)節(jié)。疏水基團:在聚合物上接枝疏水基團后，疏水性成為影響蛋白質(zhì)分配的主要因素。這種疏水性的影響由連接在高聚物上疏水基的大小和蛋白質(zhì)分子疏水區(qū)域的數(shù)量以及疏水區(qū)的粘結(jié)強度所決定。實驗表明，在P-PEG濃度很低的情況下，血清白蛋白和乳球蛋白因易于同非極性的P-PEG結(jié)合，所以不斷向上相富集。親和配基:在聚合物上接上一定的親和配基，不僅能提高萃取分配的專一性，而且能增大處理量。也可同時使用兩種配基，從而增加系統(tǒng)的選擇性，完成多種酶的分離和回收。5．近幾年雙水相萃取的主要應(yīng)用由于雙水相具諸多優(yōu)點，使其廣泛的應(yīng)用于對于分離環(huán)境要求較高的生物活性物質(zhì)的分離與純化。主要是分離蛋白質(zhì)，酶，病毒，脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分離，干擾素，細(xì)胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。此外雙水相還可用于稀有金屬／貴金屬分離，傳統(tǒng)的稀有金屬／貴金屬溶劑萃取方法存在著溶劑污染環(huán)境，對人體有害，運行成本高，工藝復(fù)雜等缺點。雙水相技術(shù)萃取技術(shù)引入到該領(lǐng)域，無疑是金屬分離的一種新技術(shù)。吳曉婷研究發(fā)現(xiàn)雙水相純化方法的純化倍數(shù)（10.69倍）和回收率（53.36%）比傳統(tǒng)的離子交換層析純化方法高。并且雙水相萃取方法簡單，更適合乙醇脫氫酶的純化【13】。Tubio等【⑷研究確定了從a-胰凝乳蛋白酶（ChTRP）中分離胰島素（TRP）的最佳條件，并將其應(yīng)用到用聚乙二醇/檸檬酸鈉（PEG/NaCit）雙水相體系從牛胰腺中液-液萃取胰島素。朱慎林、樸香蘭、沈剛等人用溴化十二烷基三乙銨（C12NE）與十二烷基硫鈉（SDS）混合體系形成雙水相萃取苯丙氨酸表明，當(dāng)C12NE與SDS摩爾比在1.6?1.7的狹小區(qū)域內(nèi)才能分相，分相系統(tǒng)對苯丙氨酸的單級萃取率達(dá)到80%以上，隨著苯丙氨酸濃度的增加，分配系數(shù)略有下降。二級萃取率達(dá)到99%以上【⑸。Salabat等e】研究了L-色氨酸、L-苯基丙氨酸、L-酪氨酸3種氨基酸298.15K時在聚乙二醇+鹽+水雙水相體系中的分離現(xiàn)象，分相鹽為硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸銨，并且還研究了連接線長度、鹽、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)對氨基酸分配系數(shù)的影響；結(jié)果表明，增加氨基酸的疏水性和連接線的長度會使分配系數(shù)相應(yīng)的增加。6．雙水相萃取技術(shù)在以后發(fā)展中的努力及前進(jìn)方向雙水相技術(shù)作為一種很有發(fā)展前景的生化分離單元操作,但其自身也存在一些不足之處,如易乳化,相分離時間較長,分離效率不高等,一定程度制約了雙水相技術(shù)的工業(yè)化推廣與應(yīng)用【5】，雙水相萃取技術(shù)與其他相關(guān)的生物分離技術(shù)進(jìn)行有效組合,可以進(jìn)一步提高分離效率或解決各自存在的難點問題。目前,雙水相萃取技術(shù)的研究進(jìn)展集中表現(xiàn)在:廉價雙水相體系的開發(fā)、新的雙水相體系探索雙水相萃取技術(shù)同其他技術(shù)集成化、雙水相萃取相關(guān)理論的進(jìn)展等方面。5.1雙水相萃取技術(shù)與其他技術(shù)的集成雙水相萃取與相關(guān)技術(shù)的集成可以歸納成為以下3個方面:①與溫度誘導(dǎo)相分離、磁場作用、超聲波作用、氣溶膠技術(shù)等常規(guī)技術(shù)實現(xiàn)集成化,改善了雙水相萃取技術(shù)中諸如成相聚合物回收困難、相分離時間較長、易乳化等問題,為雙水相萃取技術(shù)的進(jìn)一步成熟、完善奠定了基礎(chǔ)；②與色譜技術(shù)等新型生化分離技術(shù)實現(xiàn)過程集成,充分融合了雙方的優(yōu)勢,既提高了分離效率,又簡化了分離流程；③將生物轉(zhuǎn)化、化學(xué)滲透釋放和電泳等技術(shù)引入雙水相分配，給已有的技術(shù)賦予了新的內(nèi)涵,為新分離過程的誕生提供了新的思路【19】。5.2新型雙水相萃取技術(shù)（1） 雙水相萃取與磁性離子交換劑分離結(jié)合，可根據(jù)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)差異和表面電復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)的逐級選擇性分離，實現(xiàn)對特定高豐度蛋白的分離或低豐度蛋白的富集有待進(jìn)一步研究【17-18】。（2） 微膠囊雙水相萃取技術(shù)。該技術(shù)避免常規(guī)分離技術(shù)過程中的高溫、氧化、聚合等情況發(fā)生，并且使其工藝步驟少，提取效率高，能耗及生產(chǎn)費用低。（3） 親和雙水相萃取技術(shù)是在組成相系統(tǒng)的聚合物（如PEG、葡聚糖等）上耦聯(lián)特定的親和配基。親和吸附具有專一性強、分離效率高等特點。利用其特點，將親和吸附與雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合，從而構(gòu)成親和雙水相萃取體系。該體系不僅具有萃取系統(tǒng)處理量大、放大簡單等優(yōu)點，而且具有親和吸附專一性強、分離效率高的特點。（4） 生物轉(zhuǎn)化與雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合。在生物轉(zhuǎn)化過程中，隨著轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物量的增加，常會抑制生化過程的進(jìn)行。因此，及時移走產(chǎn)物是生化反應(yīng)中的主要問題之一。將雙水相系統(tǒng)與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合，形成雙水相生物轉(zhuǎn)化，解決了生物轉(zhuǎn)化過程中存在的產(chǎn)物抑制以及生物催化劑回收利用兩方面的問題，為生物轉(zhuǎn)化賦予了新的內(nèi)涵【3】。7.小結(jié)ATPE是一項可以利用不復(fù)雜的設(shè)備，并在溫和條件下進(jìn)行簡單的操作就可獲得較高收率和有效成分的新型分離技術(shù)。但ATPE技術(shù)在工業(yè)中還沒有被廣泛利用。一方面是因為兩相間的溶質(zhì)分配對于具有高度選擇性、需要從上千種蛋白中分離一種蛋白這種情況提供了很小的范圍。另一方面，如何從聚合相中回收目的產(chǎn)物、循環(huán)利用聚合物與鹽以降低成本問題還有待進(jìn)一步研究。目前ATPE技術(shù)應(yīng)用的主要問題是原料成本高和純化倍數(shù)低【2】。因此，未來雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展方向因該集中在：對液-液相平衡熱力學(xué)模型的探索，應(yīng)該加快基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的收集，尋求一套完整的理論依據(jù)；新型雙水相體系的開發(fā)，尋找更加廉價高效的雙水相體系；新工藝的開發(fā)，為實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化尋找新思路；雙水相萃取技術(shù)與相關(guān)技術(shù)的耦合，擴展雙水相萃取的應(yīng)用領(lǐng)域，減少雙水相體系自生的一些缺點帶來的影響；廢液的回收以及再利用問題，在當(dāng)今越來越重視人類生存環(huán)境的前提下，開發(fā)出環(huán)境友好、可循環(huán)利用的雙水相體系是非常有意義的【15】。參考文獻(xiàn)【1】王子佳?蛋白質(zhì)分離純化方法研究進(jìn)展?化學(xué)與生物工程.Vol.26No.8,2009?！?】郭憲厚.雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展.廣州化工.2008年，第36卷,第5期。【3】徐長波，王巍杰.雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展?化工技術(shù)與開發(fā).2009年5月，第38卷,第5期。【4】馬春宏，朱紅，王良.雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展.光譜實驗室.27卷,第5期。【5】姜大雨，朱紅，王良.離子液體雙水相萃取的應(yīng)用研究進(jìn)展.化學(xué)試劑.2010,32(9),805-810。【6】譚志堅、李芬芳、邢建敏.雙水相萃取技術(shù)在分離、純化中的應(yīng)用.化學(xué)技術(shù)與開發(fā).2010年，第8期。【7】劉云，雙水相技術(shù)國內(nèi)研究和工業(yè)應(yīng)用進(jìn)展.工業(yè)技術(shù).2011年，第11期。【8】徐長波、王巍杰.河北理工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010，第2期。9】董樹國、賴紅偉、陸釗.雙水相萃取在黃酮類化合物分離分析中的應(yīng)用.廣州化工，2009年07期。10】李敏、董慧茹，雙水相萃取-高效液相色譜法測定酵母細(xì)胞中麥角固醇含量。分析試驗室,2009年11期。11】張亞杰，夏杰，陸兵等，雙水相萃取與疏水層析分離基因工程人溶菌酶，華東理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008年02期。12】BabuBR,RastogiNK,RaghavaraoKSMS.LiquidLiquidExtractionofBromelainandPolyphenolOxidaseUsingAqueousTwo-PhaseSystem[J].ChemicalEngineeringandProcessing,2008,47(1):83—89.13】吳曉婷等.釀酒酵母中乙醇脫氫酶雙水相萃取與DEAE-32層析純化方法的比較.釀酒科技.2009年，第6期(總180期)