修飾引物十問十答

修飾引物十問十答常見的引物修飾的有哪些？常見的引物修飾包括有磷酸化（Phosphorylation）、生物素（Biotin）、地高新（Digoxigenin）、內(nèi)部氨基修飾、5'氨基修飾、3'氨基修飾、巰基（Thiol）、間臂（Spacer）、硫代（Phosphorthioate）、脫氧月尿嘧啶（DeoxyUridine，dU）和脫氧次黃嘌吟（deoxyInosine，dI）等。各種修飾引物的功能如下表:修飾說明1磷酸化(Phosphorylation)15'磷酸化可用于接頭、克隆和基因構(gòu)建以及連接酶催化的連接反應(yīng)。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相關(guān)實驗中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應(yīng)。生物素（Biotin）引物生物素標記，可用于非放射性免疫分析來檢測蛋白質(zhì)、胞內(nèi)化學(xué)染色、細胞分離、核酸分離、雜交檢測特異性的DNA/RNA序列、離子通道構(gòu)象變化等。地高新(Digoxigenin)地高新標記的探針可用于各種雜交反應(yīng)，如DNA-DNA雜交（Southernblotting）、DNA-RNA雜交（Northernblotting）、斑點雜交（Dotblotting）、克隆雜交、原位雜交以及酶聯(lián)免疫分析（ELISA）。內(nèi)部氨基修飾主要用C6-dTaminolinker來加到胸腺嘧啶殘基上來進行內(nèi)部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個原子距離，可用于進一步的標記和酶連接（如堿性磷酸酶）。目前提供內(nèi)部氨基修飾介導(dǎo)的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin修飾。5'氨基修飾可用于制」備功能化的寡核昔酸，廣泛應(yīng)用在DNA芯片（DNAMicroarray）和多重標記診斷系統(tǒng)。目前提供5'C6氨基修飾和5'C12氨基修飾兩種，前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團的連接和一些熒光標記，尤其是當熒光可能會因標記太靠近DNA鏈而被淬滅時。3'氨基修飾目前提供3'C6氨基修飾，可用于設(shè)計新的診斷探針和反義核苷酸，如5'端可用高度敏感的32P或熒光素標記的同時3'可用氨基修飾以進行其他的連接。此外，3'修飾可以抑制3'外切酶酶解，

從而可用于反義實驗。巰基(Thiol)5'-巰基在很多方面與氨基修飾類似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標記物和生物素。例如可以在碘乙酸和馬來酰亞胺衍生物存在下來制作巰基連接的熒光探針。5'的巰基修飾主要用5'巰基修飾單體(5'-Thiol-ModifierC6-CEPhosphoramidite或Thiol-ModifierC6S-SCEPhosphoramidite)o用5'-Thiol-ModifierC6-CE單體修飾后必須進行硝酸銀氧化以去除保護基(trityl)，而Thiol-ModifierC6S-SCE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。間臂(Spacer)Spacer可為寡核苷酸標記提供必要的間隔以減少標記基團與寡核苷酸間的相互作用，主要應(yīng)用于DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)和雙鏈結(jié)構(gòu)研究。C3spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羥基間的三碳間隔，或〃替代〃一個序列中未知的堿基。3'-SpacerC3用于引進一個3'間臂從而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶發(fā)揮作用。Spacer18常用于引進一個強親水基團。硫代(Phosphorthioate)主要用于反義實驗中防止被核酸酶降解。您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡g酸的Tm值會降低，為了降低這種影響，可以對引物兩端2-5個堿基進行硫代修飾，通常可選擇5'和3'各3個堿基進行硫代修飾。脫氧脲嘧啶(DeoxyUridine，dU)脫氧脲嘧啶可以插進寡g酸來增加雙鏈的熔點溫度從而增長雙鏈的穩(wěn)定性。每個脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長雙鏈熔點溫度1.7Co脫氧次黃嘌吟(deoxylnosine，dI)脫氧次黃嘌吟是一個自然存在的堿基，雖然不是真正意義上的通用堿基，但當與其它堿基結(jié)合時，會比其它堿基錯配相對更穩(wěn)定。脫氧次黃嘌吟與其它堿基的結(jié)合能力為dI:dC>dI:dA>dI:dG>dI:dT.在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌吟首選與dC結(jié)合。為什么修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價格要高？由于修飾單體穩(wěn)定性較差，偶聯(lián)時間長，效率低，最后得到的產(chǎn)量自然低于一般的引物。并且，修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失較大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產(chǎn)品的價格自然高。合成的熒光標記探針應(yīng)如何保存？熒光探針必須避光保存。干品可于-80°c保存一年以上，無條件時可于-20r保存。強烈建議用RNase-free的TE(pH8.0)buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時間更長?？蓪⑻结樑渲瞥?00pmol/ul的儲備液，分裝成幾份于-20°C保存。使用前，將配制好的儲備液稀釋成工作液(10pmol/ul或20pmol/ul)，乘lj余部分于-20C保存，防止反復(fù)凍融。修飾標記對OD值的測量有影響嗎？有些熒光基團在260nm處也有吸收光，例如FAM,HEX,TAMRA,TET。其它在260nm處可能也有吸收值，但是數(shù)據(jù)沒有公布，因此計算時不包括在里面。磷酸化是怎么回事？5'磷酸化作用是通過B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引物5'端的糖環(huán)上，而不是最后一個堿基上；3'磷酸鹽被連接到固體支持介質(zhì)上，所以在合成的第一個循環(huán)，堿基就與它偶聯(lián)。3'磷酸化修飾具有阻止聚合酶延伸的功能。Phospothioate(S-oligos)硫代引物和普通的引物有什么區(qū)別？S-oligos是寡核苷酸中的單核苷酸之間的磷酸二酯鍵中的一個氧被硫代替后形成的。這種修飾是在連接的時候進行的(不是在合成后進行的)。堿基被添加上后，再進行連接修飾。在兩個堿基之間的磷酸可以轉(zhuǎn)換成雙鍵"S"(用硫代試劑)代替普通的雙鍵"O"(用碘溶液)，和磷酸二酯鍵相連的堿基都可以進行這種修飾。氨基修飾的原理是什么？注意事項是什么？5'Aminolinker(C6)是在合成循環(huán)的最后一步以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引物5'糖環(huán)上的，而不是添加到最后一個堿基上。5'氨基標準的偶聯(lián)效率是＞95%,氨基基團在260nm處是沒有吸光值的；它在210nm處有吸光值。不能通過電泳檢測它的存在(瓊脂糖或丙烯酰胺)。3'Aminolinker(C7)只與一些5'修飾兼容，如FAM,HEX,TET,Fluorescein,Biotin,Amine,andphosphate。其它的5'修飾(如Alexadyes)需要氨基才能與寡核苷酸相連，這就無法避免該染料與3'氨基相連。常見的熒光染料有哪些?縮寫全名吸收波長發(fā)射波長顏色6-FAM6-carboxy-fluorescein1494nm518nmGreenTET5-tetrachloro-fluorescein521nm538nmOrangeHEX5-hexachloro-fluorescein535nm553nmPinkTAMRAtetramethyl-6-carboxyrhodamine560nm582nmRoseROX6-carboxy-x-rhodamine587nm607nmRedCy3Indodicarbocyanine552nm570nmRedCy5Indodicarbocyanine643nm667nmViolet淬滅基團為TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的雙標記熒光探針在使用上有什么不同？由淬滅基團TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標記熒光探針常常被用作水解探針(HydrolysisProbes)，或稱TaqMan探針，用于實時熒光定量PCR實驗。TAMRA為熒光染料，在淬滅報告基團的同時，會在更高波長處發(fā)射熒光。而Eclipse及BHQ系列為非熒光染料，淬滅報告基團時，自身不發(fā)射熒光，探針熒光本底比TAMRA低，檢測靈敏度更高。TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報告基團種類較少；而Eclipse則具有更寬的吸收范圍(390nm-625nm)，可淬滅的報告基團種類很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團種類更多，包括Cy3、Cy5等。因此可由Eclipse或BHQ系列