細胞的凍復蘇與運輸課件

第六章

細胞的凍存、復蘇與運輸

細胞冷凍、復蘇的發(fā)展歷史簡介

1776年，Spallanzani最早發(fā)表了“冷”處理對“細胞”生命活動影響的報道。

到了1900年前后，科學家基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存的事實。

1949年，Polge等人發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存細胞的保護作用。Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學者發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)濃度增大是造成冷凍貯存細胞損傷的主要原因。

1959年，Lovelock等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學保護劑，這就是現(xiàn)在人們熟知的二甲基亞砜(DMSO)。

當前低溫液氮凍存貯存細胞已是細胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù)，貯存時間幾乎是無限的。

一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復蘇原理冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫條件)，并在此溫度下對其長期保存的過程。復蘇(thawing)：是以一定的復溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復到常溫的過程。

無論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。

溶質(zhì)損傷：因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細胞損傷被稱為溶質(zhì)損傷。

細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降，細胞外部的水分會先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)的濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏。

溶質(zhì)損傷是由冷卻速度過慢，使細胞在高濃度的溶液中暴露的時間過長而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴重如果在溶液中加入冷凍保護劑時，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。保護機理：冷凍保護劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成；通過降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。

影響冷凍效果的因素有以下幾點：

1.冷凍速率

不同的冷凍速度既然能使細胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細胞產(chǎn)生不同的損傷。當冷凍速度過慢時:細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。

當冷凍速度過快時:細胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較大冰晶,造成細胞膜及細胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。

2.冷凍保存溫度：

液氮溫度(-196℃)是目前最佳冷凍保存溫度。應(yīng)用-70℃～-80℃條件冷凍保存細胞，短期內(nèi)對細胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯下降。如-70℃凍存SNL細胞(一種小鼠成纖維細胞)，一個月內(nèi)復蘇，細胞存活率在90%以上；但一個月后，細胞存活率卻降至50%左右；若時間再延長，細胞存活率更低甚至為零。

不同細胞的最適冷凍速率不同。例如，小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞的最適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min和200℃/min。

4.冷凍保護劑：是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。分為：滲透性：常用甘油、DMSO

非滲透性甘油或二甲基亞砜這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。

保護機制:在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時，細胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外達到平衡以起到充分的保護作用。目前，DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛。

注意：由于許多冷凍保護劑(如DMSO))在低溫條件下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫融解后要及時洗除冷凍保護劑。二、冷凍保存方法

按照冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種

非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-70～-80℃，然后投入液氮進行保存；該種方法凍結(jié)的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。

玻璃化冷凍則是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細胞懸液沒有冰晶的形成。

玻璃化凍存法對細胞活性的保存具有較好的效果，不需要復雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細胞的凍存。這可能與需要配制較復雜的凍存液以及冷凍前和復蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。

2.凍存過程(1)待凍存細胞懸液的準備

①按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物,制備成單細胞懸液,計算細胞總數(shù)。②將細胞懸液以800～1000r／min離心5min，棄上清液。③向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細胞密度達1×106～1×107個/ml。④按每管1～1.5ml的量，分裝于凍存小管內(nèi)。擰緊管蓋。⑤在凍存小管上做標記，包括細胞代號及凍存日期。(2)分級冷凍：（有幾種方法可以使用）①先將凍存小管放人普通冰箱冷藏層(4～8℃)，約40min。②接著置于普通冰箱冷凍層(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下過夜。⑤最后將凍存小管投入液氮保存。還有一種簡單的方法，就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20min，再直接投入液氮中保存。第三種方法是，用4℃預冷的冷凍保護液懸浮細胞，分裝凍存小管后，將凍存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒內(nèi)封好，立刻將小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再將凍存小管投入液氮中保存。(3)記錄：做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及凍存經(jīng)手人。3.凍存結(jié)果如此凍存的細胞，其存活率可達90%以上。三、非玻璃化凍存細胞的復蘇

1.主要材料(1)儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、普通離心機。(2)培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

2.復蘇過程1)將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至37～40℃。2)從液氮中取出凍存小管，立即投入37～40℃溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解。

要在1～2min內(nèi)完成復溫。許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。對絕大多數(shù)細胞而言，1%以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。但對極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO。3)將細胞凍存懸液移入離心管，加入約5m1培養(yǎng)液，輕輕吹勻。4)將細胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min。棄上清液。5)給細胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。