用血紅蛋白的提取與分離

用血紅蛋白的提取與分離第1頁/共32頁(一)蛋白質(zhì)分離和提取的原理一.基礎(chǔ)知識根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異：分子的形狀、大小電荷性質(zhì)和多少溶解度吸附性質(zhì)對其他分子親和力

第2頁/共32頁高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白第3頁/共32頁（二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法凝膠色譜法：又稱分配色譜法電泳法第4頁/共32頁1.凝膠色譜法2）材料：凝膠(分配色譜法)1）概念

根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法凝膠是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內(nèi)部有許多貫穿的通道。第5頁/共32頁第6頁/共32頁3.凝膠色譜法的原理—分子篩效應大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。第7頁/共32頁凝膠色譜柱洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。第8頁/共32頁2.電泳1)概念帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程2)原理利用了待分離樣品中各分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。第9頁/共32頁3)類型:瓊脂糖凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳4)實例：SDS——聚丙稀酰胺凝膠電泳用途:測定蛋白質(zhì)的分子量鑒定蛋白質(zhì)的純度原理：SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。使電泳遷移速率完全取決于分子的大小。第10頁/共32頁討論：如何測定蛋白質(zhì)的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標準曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。

第11頁/共32頁血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團

血液有哪些成分？

第12頁/共32頁(三)緩沖溶液抵制外界的酸或堿對溶液pH值的影響，維持pH基本不變1.作用2.配制如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4

說出人體血液中緩沖液?

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。第13頁/共32頁二.實驗操作(1)紅細胞的洗滌(2)血紅蛋白的釋放(3)分離血紅蛋白溶液樣品處理粗分離純化純度鑒定透析除去分子較小的雜質(zhì)通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度第14頁/共32頁

二、實驗操作1.樣品處理：（二）操作過程

本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。用雞的紅細胞提取DNA，用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取；人的紅細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。第15頁/共32頁1.洗滌紅細胞洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果第16頁/共32頁1.洗滌紅細胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化第17頁/共32頁2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質(zhì)？2.為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分攪拌的目的是____________________________。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞的破裂第18頁/共32頁3.分離血紅蛋白分離過程紅細胞破碎混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯2000r/min的速度第19頁/共32頁(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以

2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色

透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白

色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

二、實驗操作第20頁/共32頁2、血紅蛋白的粗分離----透析：①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的

磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

實驗操作原理：透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內(nèi)。第21頁/共32頁透析過程動畫演示第22頁/共32頁純化——凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作2.凝膠色譜柱的裝填3.樣品的加入和洗脫第23頁/共32頁純度鑒定使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標準曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。

第24頁/共32頁第25頁/共32頁觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三.實驗結(jié)果分析與評價1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？第26頁/共32頁由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？第27頁/共32頁如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅