冷凍復(fù)蘇技術(shù)課件

冷凍復(fù)蘇技術(shù)概述

Spallanzani（1776）最早發(fā)表了冷“處理”對“細胞”生命活動影響的報道，他用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，發(fā)現(xiàn)了一個令人驚奇的現(xiàn)象，那些原本已經(jīng)不動了的精子又“復(fù)活”了，就好象是剛從輸精管排出來的一樣，冷處理延長至數(shù)十分鐘，情況依然如此。于是，他認為冷不能殺死精子。大約100年以后，許多早期的學(xué)者重復(fù)了低溫處理對精子活動的影響，同樣得出了相似的結(jié)論。到1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分（如精子和一些生物化學(xué)物質(zhì)）能夠在零下溫度貯存的事實。Shettles（1940）證明人類的精子也能抵抗溫度的突然變化，他將人的精液封閉在小管內(nèi)，在-790C～-1960C之間的低溫條件下進行冷處理，發(fā)現(xiàn)有10%的精子仍然能夠存活。此后，冷凍處理研究材料的范圍大大拓展。Polge等人（1949）發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存的細胞具有保護作用，他們?nèi)匀灰跃舆M行研究發(fā)現(xiàn)，加入甘油能夠大大提高貯存于-790C下精子的存活率。接下來的重大進展是Luyet（1951）與Lovelock（1953）等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對貯存細胞的損傷作用。他們的結(jié)論是，電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細胞損傷的主要原因。冷凍理論后來得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith（1961）等學(xué)者的繼續(xù)和發(fā)展。1949年至1960年這一段時間可以稱為冷凍保存的“甘油時期”，這一時期對生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護劑。Lovelock（1959）等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。而且，用于冷凍保存的儀器也有明顯的發(fā)展。目前，無論是冷凍保存理論、各種保護劑、冷凍用品和設(shè)備以及各種生物材料的保存與復(fù)蘇技術(shù)都已十分成熟和完備。冷凍保存與復(fù)蘇原理

在低于-700C的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股顒庸潭ㄔ谀骋浑A段而不衰老死亡。當以適當?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-700C的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復(fù)蘇。水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時，大量水分會因此進入細胞內(nèi)，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當溫度進一步下降，細胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。冷凍保存溫度冷凍保存溫度是指能長期保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同。但從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（-1960C）是目前最佳的冷凍保存溫度。在-1960C時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C～-800C保存細胞，短期內(nèi)對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在冰點到-400C范圍內(nèi)保存細胞的效果不佳。冷凍保護劑冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數(shù)有核哺乳動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～6000C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細胞會死亡；而加入甘油冷凍保護劑進行冷凍保存時，98%以上的細胞都可存活。冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時，細胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外達到平衡以起到充分的保護作用。目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細胞的毒性作用較大，而在40C時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細胞內(nèi)。所以，凍存時DMSO平衡多在40C下進行，一般需要40～60分鐘非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)、缺點。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護劑組成保護液。由于許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復(fù)溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。

復(fù)蘇速率冷凍保護體外培養(yǎng)物，除了必須有最佳的冷凍速率、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時也必須有最佳的復(fù)溫速率，這樣才能保證最后獲得最佳冷凍保存效果。復(fù)溫速率是指在細胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當也會降低凍存細胞存活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在370C水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細胞損傷。復(fù)溫時造成的細胞損傷非?？欤跇O短的時間內(nèi)發(fā)生。馬蒂諾特的父親守在妻子的“冰棺”前。冷凍卵子

全球第一例冷凍卵子1986年就在澳大利亞成功妊娠。但由于復(fù)蘇率較低，此項技術(shù)發(fā)展一直較為緩慢。卵子冷凍的取卵過程與試管嬰兒的取卵相同，而冷凍方法有程序冷凍法和玻璃化冷凍法兩種，目前一