辣根過氧化物酶的提取純化以及應(yīng)用

辣根過氧化物酶的提取純化以及應(yīng)用第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二辣根過氧化物酶簡介辣根，是十字花科多年生直立草本植物，在世界大部分溫和地區(qū)都有種植。它的根不但可以烹調(diào)，同時還含有一種含量豐富的過氧化物酶，這些同工酶統(tǒng)稱為“辣根過氧化物酶(HRP)”。其中含量最為豐富的是辣根過氧化物酶同工酶C(HRPC)現(xiàn)在HRPC的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制已經(jīng)被闡明第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二結(jié)構(gòu)反應(yīng)機(jī)理分離純化特性分析應(yīng)用第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二HRP的結(jié)構(gòu)

辣根過氧化物酶同工酶C是一條由308個氨基酸組成的肽鏈。在這條肽鏈中有4個由兩分子半胱氨酸組成的二硫鍵,它們分別是11～91、44～49、97～301和17～209;同時還存在一個由Asp99和Arg123組成的鹽橋。第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二HRP的結(jié)構(gòu)HRPC含有兩個不同的金屬中心:正鐵原卟啉(即血紅素)和兩個鈣原子。這兩個金屬中心對酶的整體結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的。通過血紅素中鐵原子的一個軸向結(jié)合點(diǎn)與肽鏈上His170側(cè)鏈的N原子結(jié)合,使血紅素垂直連接在His170上(下圖);而卟啉鐵的另一個軸向結(jié)合點(diǎn)在靜態(tài)酶中則是空著的,當(dāng)有H2O2

存在時,該結(jié)合點(diǎn)就能與CO、氰化物、氟化物或疊氮化物等小分子結(jié)合。第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二HRPC的部分結(jié)構(gòu)特征第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二HRPC三維結(jié)構(gòu)第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二HRP的結(jié)構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)總體上看來大部分是α螺旋,但其中也包含一些小的β折疊。在血紅素平面上下兩側(cè)存在著兩個空白區(qū)域,該區(qū)域可能是由鈣結(jié)合位點(diǎn)與其他結(jié)構(gòu)元素共同作用而成的,也可能是基因復(fù)制后留下的產(chǎn)物。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二HRP的結(jié)構(gòu)在血紅素平面的上下兩側(cè)存在著兩個鈣原子的結(jié)合位點(diǎn),它們通過一個氫鍵群與血紅素結(jié)合區(qū)域相連。每個鈣原子都是7供氧配合體,它們能同時與主肽鏈上含羰基的氨基酸,側(cè)鏈上的Asp、Ser和Thr,以及一個末端結(jié)構(gòu)水分子結(jié)合。鈣離子的丟失將會導(dǎo)致HRPC酶失活和熱穩(wěn)定性的下降,還能使血紅素的構(gòu)型發(fā)生改變。第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二HRP的作用機(jī)制由HRP催化的多數(shù)反應(yīng)可由以下等式表示：

AH+H2O2

→·A+2H2O其中AH是還原性底物,·A是自由基。還原性底物包括芳香族化合物,酚類化合物,吲哚,胺類和磺酸鹽。第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二

HRPC以阿魏酸為底物的催化循環(huán)第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二催化循環(huán)的第一步是H2O2和靜態(tài)酶中的Fe(Ⅲ)反應(yīng)生成化合物Ⅰ(HRPⅠ),HRPⅠ是一個高氧化態(tài)的催化中間體,包含一個含氧Fe(Ⅳ)中心和一個帶正電荷的卟啉。由一分子還原性底物的加入HRPⅠ,生成另一個含有含氧Fe(Ⅳ)中心的催化中間體HRPⅡ。由一分子還原性底物參加HRPⅡ,使HRPⅡ還原成靜態(tài)酶。圖中生成的兩個帶電子的產(chǎn)物可能會引起更復(fù)雜的反應(yīng),包括形成二倍體、三倍體、多聚體,以及啟動一個以該產(chǎn)物為底物的反應(yīng)。第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二辣根過氧化物酶的分離純化新鮮干凈辣根勻漿尼龍紗布過濾上清40%-80%硫酸銨鹽析沉淀用水溶解并在水中進(jìn)行透析用-20℃丙酮制沉淀離心，取上清水溶解并透析第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二辣根過氧化物酶的分離純化梯度洗脫取第二個酶純高峰部分在自來水中透析上樣于CM-23纖維素上樣于DEAE-52取酶活高峰部分濃縮，既得純化辣根過氧化物酶梯度洗脫第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二

pH對

HRP活力的影響在不同的酸度條件下,分別測定辣根過氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化OPD的初始反應(yīng)速率(dA/dt),以dA/dt對pH值做圖發(fā)現(xiàn),在pH值4.5～4.75范圍內(nèi),HRP活力呈上升趨勢,至pH值為4.75時HRP活力達(dá)到最大.以后隨著pH值的增高,其活力呈下降的趨勢.HRP催化H2O2氧化OPD體系的最適pH為4.75.第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二pH對辣根過氧化物酶活力的影響pH對溶液中HRP穩(wěn)定性的影響第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二

pH對

HRP穩(wěn)定性的影響HRP分別在pH2.5～5溶液中保純7天后,HRP催化反應(yīng)速率為0,說明HRP在該條件下保純7天后已完全失活.在pH6.0～8.0范圍內(nèi),HRP催化反應(yīng)的初始速率隨pH值的增加而逐漸增大.當(dāng)pH值達(dá)到8.0以后反應(yīng)速率趨于穩(wěn)定,說明HRP在偏堿性緩沖液中的穩(wěn)定性較高,而在酸性條件下HRP容易失活,其原因可能是由于在堿性條件下酶的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,酶活性處于休眠狀態(tài)第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二辣根過氧化物酶應(yīng)用酚類化合物是常見的有毒有機(jī)污染物,含酚廢水在我國水污染控制中被列為重點(diǎn)解決的有害廢水之一,它的大量排放對水體、土壤造成嚴(yán)重的污染,進(jìn)而危害人類的健康。HRP在H2O2存在時能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。張國平等人對用辣根過氧化物酶處理廢水中的五氯酚進(jìn)行了研究第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二

pH值對去除率的影響

在pH=2～8的范圍內(nèi)測定了五氯酚在辣根過氧化物酶和H2O2

的作用下的去除率。實驗結(jié)果見左圖。由圖可見,在pH值為4和5時,去除率達(dá)95%以上,為最佳pH范圍。

pH值對去除率的影響第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二

H2O2

對去除率的影響采用不同的H2O2

用量與0.05mmol/L五氯酚進(jìn)行實驗(辣根過氧化物酶是過量的),測定五氯酚的去除率,結(jié)果見左圖。當(dāng)H2O2

用量為0～0.025mmol/L時,五氯酚去除率按比例上升(也即殘余五氯酚濃度按比例下降),表明H2O2

與PCP有著固定的反應(yīng)計量比。當(dāng)H2O2達(dá)到0.025mmol/L以上時,去除率已達(dá)最高,說明這時H2O2

用量已飽和。

H2O2

對去除率的影響第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二不同條件下的去除速率總的來說,反應(yīng)是相當(dāng)快的,所有的反應(yīng)都在15min內(nèi)進(jìn)行了一半以上。當(dāng)H2O2/PCP相同時,酶用量多,則反應(yīng)速度快。對于H2O2/PCP=0.5的2個反應(yīng),酶用量為0.1U/mL時只用15min就獲得了80%以上的去除率,而酶用量為0.05U/mL時則用了40min。當(dāng)酶用量相同(同為0.1U/mL)時,H2O2/PCP=1時的去除速度比H2O2/PCR=0.5時要快,前者只用8min就獲得了80%以上的去除率,而后者則用了15min。適度增加H2O2

可以加快反應(yīng),太過量的H2O2

也會對反應(yīng)有抑制作用不同條件下的去除速率第21頁，共22頁，2023年，2月20日，星期二其他應(yīng)用辣根過氧化物酶是臨床