一株海洋瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離、篩選和初步鑒定

一株海洋瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離、篩選和初步鑒定劉美英，梅建鳳，應(yīng)國清，王鴻(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014)摘要：目的從海水中分離活性較高的瓊膠酶產(chǎn)生菌，以制備瓊膠酶用于瓊膠寡糖的生產(chǎn)，瓊膠寡糖具有多種生物活性，在食品、化妝、醫(yī)藥等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。方法以瓊膠為唯一碳源，用稀釋涂布平板法進行分離，平板透明圈法進行初篩，搖瓶培養(yǎng)法進行復(fù)篩，改進的DNS比色法進行酶活力的測定。結(jié)果從海水中分離篩選到18株瓊膠降解菌株，經(jīng)復(fù)篩得到一株產(chǎn)酶活力較高的海洋細菌HS0326-601，并對該菌株進行了初步鑒定，結(jié)果表明其為革蘭氏陰性細菌，菌體呈短桿狀。結(jié)論鑒于該菌株生長速度快，通過對其進一步的誘變和發(fā)酵條件優(yōu)化，有望成為高產(chǎn)瓊膠酶產(chǎn)生菌，從而為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：瓊膠降解菌；瓊膠酶；分離；篩選中國分類號：文獻標(biāo)識碼：A文章編號：0000-0000(2008)00-0000-00Isolation,ScreeningandIdentificationofAgaraseProducingBacteriafromtheSeawaterLIUMei-ying,MEIJian-feng,YINGGuo-qing*,WANGHong(Collegeofpharmaceuticalscience,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China)ABSTRACT:OBJECTIVETodegradeagarintoagaro-oligosaccharidebytheagarasewithahigheractivity,thestrainswereseparatedfromseawater.Theagaro-oligosaccharidehaveshownwideapplicationvaluesinfoodindustry,cosmeticindustry,pharmaceuticalindustryandothersectors.METHODSTheagarase-producingbaceriawereisolatedbythespreadplatemethod,first-screeningbyclearhalosonagarplatecontainingagarasthesole-carbonsource,second-screeningofshakingculture.TheenzymaticactivitiesweredeterminedbyimprovedDNScolorimetrymethod.RESULTS18agar-degradingstrainswereisolatedfromtheseawater,andamorepowerfulagarase-producingmarinebacteriumwasobtained.ThestrainwasdesignatedasstrainHS0326-601andidentifiedpreliminarilyasGramnegative,rod-shaped.CONCLUSION基金項目：浙江省科技計劃項目(2007C33068)作者簡介：劉美英，女，碩士研究生*通訊作者：應(yīng)國清，男，教授，碩士生導(dǎo)師Tel:(0571)88871029E-mail:gqying@Withregardtoitshighgrowthspeed,iffurthertreatedwithmutagens,thestrainmightbeonewithahighenzymicactivityafterfermentationoptimization,anditcouldbeusedtothefurtherstudyandappliedtothepreparationofagaraseforagaro-oligosaccharideproductioninindustry.KEYWORDS:agarase-producingbacteria;agarase;isolation;screening瓊膠(agar)是一種從海洋紅藻中提取得到的多糖，其在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)已有悠久的應(yīng)用歷史，但由于瓊膠黏度高，水溶性低，不易被吸收，因此在應(yīng)用方面受到很大的限制。而瓊膠寡糖(agaro-oligosaccharide)，即瓊膠多糖經(jīng)水解后聚合度為2~10的低聚糖，又稱瓊膠低聚糖，主要由瓊二糖的重復(fù)單位連接而成，水溶性好，有利于人體吸收，大大提高了其應(yīng)用價值，瓊膠寡糖具有較強的抗癌［L2］、抗氧化［3,4］、抗炎［2,5］及抗病毒［L6］等活性，是一種極具開發(fā)潛力的低聚糖。瓊膠酶能降解瓊膠生成瓊膠寡糖，與瓊膠的化學(xué)降解相比，瓊膠酶降解瓊膠則具有特異性強的優(yōu)點，可選擇性地酶解切斷特定化學(xué)鍵，從而制得特定聚合度的寡聚糖，并且具有反應(yīng)條件溫和，降解過程易于控制，無副反應(yīng)，環(huán)境污染少等優(yōu)點，在制備瓊膠寡糖中具有明顯的優(yōu)勢。除了制備瓊膠寡糖之外，瓊膠酶還可用作工具酶、用于回收DNA或RNA、海藻多糖結(jié)構(gòu)的研究等［7,8］。我國對于海藻多糖降解酶的研究尚處于起步狀態(tài)，進行的研究大多局限于產(chǎn)酶菌株的篩選、酶的制備、純化與性質(zhì)分析、及酶的應(yīng)用等方面，還未見關(guān)于其投入規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)的報道，關(guān)鍵就在于缺乏酶活力高的菌株［9］。因此篩選高產(chǎn)瓊膠酶產(chǎn)生菌具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。目前，瓊膠酶產(chǎn)生菌可以從海水、海洋動物腸道、底泥等海洋環(huán)境以及湖泊、河流、排污口等陸地環(huán)境中獲得［1,10~12］，甚至從菠菜根系中也可篩選到瓊膠降解菌株［13］，但大多數(shù)瓊膠酶產(chǎn)生菌從海洋環(huán)境中分離得到［1］。本實驗先后從舟山、臺州等地采集海水樣，從中分離篩選到一株活力較高的菌株，并對其進行了初步鑒定。旨在為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1海水樣品取自浙江舟山冊子島、金塘和朱家尖等藻類繁殖地和臺州溫嶺箬橫、塢沙門及三門等紫菜養(yǎng)殖地海水。1.1.2培養(yǎng)基組成分離培養(yǎng)基（%）：NaCl2.5；NH4C10.1；MgSO4*7H2O0.5；KCl0.1；FeSO4*7H2O0.002；CaC120.02；NaH2PO40.06；瓊脂2；pH7.0。斜面培養(yǎng)基（%）：NaCl2.5；酵母浸出粉0.5；MgSO4*7H2O0.5；KCl0.1；FeSO4*7H2O0.002；CaCl20.02；NaH2PO40.06；葡萄糖0.1；瓊脂2；pH7.0。復(fù)篩培養(yǎng)基（%）：瓊脂0.2；酵母浸出粉0.25；其他成分同海水分離培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均為121°C、20min滅菌；液體培養(yǎng)基裝量為35ml/250ml搖瓶。1.2方法1.2.1海水樣品的采集采集海水樣品裝于塑料瓶中，紫菜等樣品裝于樣品袋中。采集的樣品置于4C冰箱保存。1.2.2樣品的馴化富集取瓊膠適量，海水樣品40mL,在酒精燈旁加入250mL錐形瓶中，28C、200rmin-1連續(xù)振蕩培養(yǎng)，定期加入適量蒸餾水至原體積，目測培養(yǎng)液明顯混濁后，取培養(yǎng)液4mL接種于含瓊膠5g、36mL該海水樣品的三角瓶中，重復(fù)上述培養(yǎng)過程。1.2.3菌株的分離采用稀釋涂布平板法：用無菌移液管吸取海水或富集樣品5mL，加入含一層玻璃珠和45mL無菌人工海水的三角瓶中，200rmin-1振蕩30min，混勻制成菌懸液，用無菌人工海水適當(dāng)稀釋，移取0.2ml涂布于分離培養(yǎng)基平板上，28C培養(yǎng)，直至平板上長出菌落。1.2.4菌株的初篩觀察平板上菌落形態(tài)，挑取周圍形成明顯凹陷的菌落，并在平皿底部作標(biāo)記，再滴加盧戈氏碘液染色。保留那些平板上能產(chǎn)生透明圈菌落的對應(yīng)斜面，棄去染色后無透明圈菌落的對應(yīng)斜面，將前者置于28C培養(yǎng)，供復(fù)篩用。1.2.5菌株的復(fù)篩用接種環(huán)挑取初篩菌株的新鮮斜面菌苔2環(huán)，接入復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基中，28C、200r-min-1發(fā)酵培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液于3000rmin-1下離心10min后取上清液測酶活力，篩選出產(chǎn)酶活力最高的菌株進行純化。1.2.6菌種純化用接種環(huán)挑取復(fù)篩得到的新鮮斜面種菌苔，用無菌人工海水適當(dāng)稀釋，取0.2mL涂布于分離培養(yǎng)基平板上。28°C培養(yǎng)，直至平板上長出菌落，將單菌落挑至斜面上培養(yǎng)。然后進行復(fù)篩，方法同1.2.4，篩選出產(chǎn)酶活力最高的菌株用于發(fā)酵產(chǎn)酶。1.2.7瓊膠酶活力的測定粗酶液的制備將發(fā)酵液于3000rmin-1下離心10min后上清液即為粗酶液。改進的DNS比色法測定瓊膠酶活力用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制0.2%的瓊膠底物溶液20mL。加入4mL待測酶液，35C、150r-min-1搖床反應(yīng)1h。立即取1mL反應(yīng)液于帶有刻度的試管中，加入0.5mLDNS溶液于沸水浴中共熱5min后立即冷卻全室溫，定容至10mL。測520nm波長處的吸光度。酶活力單位定義在上述反應(yīng)條件下，1mL酶液1min產(chǎn)生lpg還原糖為一個酶活（U）。1.2.8菌體濃度的測定采用紫外-可見分光光度法在620nm波長下測定培養(yǎng)液的吸光度。1.2.9菌株的初步鑒定瓊膠降解菌株的初步鑒定按參照文獻［14］進行。首先觀察菌落形態(tài)、鏡檢觀察個體形態(tài)，革蘭氏染色，再作進一步鑒定。2結(jié)果與分析2.1瓊膠降解菌株的篩選2.1.1菌株的初篩在對舟山、臺州各地的海水樣進行早期篩選后發(fā)現(xiàn)，溫嶺箬橫紫菜養(yǎng)殖地的海水樣中的瓊膠酶產(chǎn)生菌較多，且產(chǎn)酶活力也較高。故在本研究中對該海水樣進行馴化富集，以瓊膠為唯一碳源進行富集培養(yǎng)，以期獲得更多、酶活力更高的瓊膠降解菌株。平板培養(yǎng)后用盧戈氏碘液染色，瓊膠與碘結(jié)合而被染色。產(chǎn)瓊膠酶的菌株，由于其菌落周圍瓊膠被降解形成瓊膠寡糖，而瓊膠寡糖具有還原性，不能著色，因此其菌落周圍可形成透明圈，這樣便可以很好地從海水樣中分離篩選

到瓊膠降解菌。觀察培養(yǎng)基平板可發(fā)現(xiàn)菌落所在的培養(yǎng)基呈釜底形凹陷，并且有較大的透明圈，篩選的平板透明圈見圖1。采用此法，分離到了18株瓊膠降解菌，分別測定其菌落直徑和透明圈直徑，結(jié)果見表1。圖1瓊膠酶篩選平板經(jīng)盧戈氏碘液染色后的照片F(xiàn)ig.1PhotographoftheagarplatestainedbyLugol’sforagarolyticstrainsscreening表118株瓊膠降解菌菌落直徑和透明圈直徑Tab.1Diameterofcolonyandhalofrom18strainsStrainsDiameterofcolonies(DC)/cmDiameterofinnerclearhalos(DH)/cmHCvalue(DH/DC)10.2140.4382.04720.2300.4662.02630.2020.4282.11940.1620.3602.22250.1860.3902.09760.5241.0181.94370.1200.3042.53380.2400.4842.01790.2160.3981.843100.1980.4122.081110.1000.2862.860120.0540.2083.852130.1180.2462.085

140.2140.5362.505150.1880.4882.596160.8302.0162.429170.2000.4522.260180.2100.5102.429由表1可以看出，6、14、16號菌株所產(chǎn)的透明圈較大，但由于即使同一個平皿上長出的菌落，其大小也不一，細胞生物量也有所不同，透明圈的大小并不能反映菌株產(chǎn)酶的比活性，因此分別測定它們的菌落直徑，但發(fā)現(xiàn)這18株菌株的HC值（Dh/DC）也相差不大。為了客觀地反映菌體的生長和產(chǎn)酶能力，將此18株菌株進行進一步的篩選。2.1.2菌株的復(fù)篩利用平板初篩只能定性地挑選出產(chǎn)酶菌株，而以搖瓶培養(yǎng)形式進行的復(fù)篩則可以定量地比較各菌株產(chǎn)酶活力及其菌體生長情況。復(fù)篩培養(yǎng)基仍以瓊膠作為唯一碳源，培養(yǎng)48h后分別測定發(fā)酵液的瓊膠酶活力和菌體濃度。結(jié)果見表2。表2復(fù)篩各菌株產(chǎn)酶活力的比較Tab.2ComparisionofagaraseactivityproducedbydifferentstrainsStrainsEnzymeactivity/UConcentrationofstrains(OD620)19.381.96424.251.08639.201.61245.090.81354.430.719612.091.19075.091.44483.591.46994.900.618105.461.572116.020.807123.870.693135.091.134144.811.534156.580.7621611.250.285175.271.012186.581.639由表2可見，6和16號菌株的酶活較高，分別為12.09U和11.25U,選前者作為高產(chǎn)菌株，編號為HS0326-6。在此值得一提的是，16號菌株的透明圈直徑為2.016cm，其HC值為2.429cm，而6號菌株透明圈和HC值各為1.018cm和1.943cm?？梢?6號菌株的透明圈和HC值均比6號大，而前者的酶活卻不如后者，其他菌株的情況也與此類似，這就說明在評價菌株產(chǎn)酶活性高低時，應(yīng)以搖瓶復(fù)篩數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，而初篩中透明圈和HC值的大小僅作參考。這與湯海青[9]指出的“透明圈的大小與菌株產(chǎn)酶活性的高低有一定正相關(guān)”并不一致。關(guān)于透明圈和酶活之間的關(guān)系，有待進一步研究。2.1.3菌種純化從自然環(huán)境中的微生物樣品，經(jīng)過一次分離形成單菌落，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)得到的菌株，因脫離了自然環(huán)境條件，在傳代培養(yǎng)中細胞發(fā)生性狀衰退的頻率增加，直接使用往往存在酶活急劇下降，甚至喪失酶活，需要經(jīng)過多次純化培養(yǎng)才能達到穩(wěn)定的遺傳。實驗對復(fù)篩得到的高產(chǎn)瓊膠降解菌株HS0326-6進行試管斜面活化和平板再次純化，以篩選出產(chǎn)酶活力較高且穩(wěn)定的菌株。經(jīng)過純化培養(yǎng)，得到高產(chǎn)菌株HS0326-601，其酶活為20.78U，較純化前提高了72%，且酶活穩(wěn)定。2.2菌株HS0326-601的初步鑒定菌株HS0326-601在分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，3-4d天可以形成菌落，菌落大小中等。菌落形態(tài)特征為：菌落呈圓形，淡黃色，邊緣整齊，表面濕潤，中央凹陷，不透明（圖2）。斜面培養(yǎng)21h左右菌苔鋪滿斜面，菌苔呈淡黃色，厚度中等（圖3）。鏡檢觀察菌株的個體形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果表明，菌株HS0326-601為革蘭氏陰性細菌，菌體呈短桿狀，見圖4。

圖2瓊膠降解菌的平板純化圖Fig.2Clonesofagarolyticbacteriainplatecultivation圖3瓊膠降解菌的斜面培養(yǎng)Fig.3Tubecultureofagarolyticbacteria圖4顯微鏡觀察的菌體(放大1000倍)Fig.4Theshapeofstrainobservedbymicroscopy(x1000)3討論3.1在對紫菜養(yǎng)殖地的海水樣、紫菜樣及土樣進行早期篩選后發(fā)現(xiàn)，海水樣中篩選到的瓊膠降解菌株較多，且產(chǎn)酶活力明顯高于后兩者。故本實驗對海水樣進行馴化富集，以期獲得更多、產(chǎn)酶活力更高的瓊膠降解菌株。3.2本實驗中發(fā)現(xiàn)，透明圈和HC值均較大的菌株，其酶活不一定較高，說明在評價菌株產(chǎn)酶活性高低時，我們應(yīng)以搖瓶復(fù)篩數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，而初篩中透明圈和HC值的大小僅作參考。3.3菌株HS0326-601在分離培養(yǎng)基平板上生長較慢，一般需要3~4d左右才能長成大小適宜的單菌落。而斜面培養(yǎng)時生長則較快，培養(yǎng)21h左右即可長出較厚的菌苔。鑒于該菌株生長速度快，通過對其進一步的誘變和發(fā)酵條件優(yōu)化，有望成為高產(chǎn)瓊膠酶產(chǎn)生菌，從而為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外，實驗中還發(fā)現(xiàn)此類菌株對環(huán)境變化較為敏感，遺傳性能不夠穩(wěn)定，多次傳代后產(chǎn)酶活力有所下降。因此，在后續(xù)實驗中，除了對菌種進行保藏之外，還需對菌株進行定期活化。目前正在對此菌株進行進一步的鑒定，同時，為提高其產(chǎn)酶活力，對該菌株的誘變選育和發(fā)酵條件優(yōu)化也正在進行之中。REFERENCES[1]WANGJX,MOUHJ,JIANGXL.Biologicalactivitiesofaneutralwater-solubleagarpolysaccharidepreparedbyagarasedegradation[J].HighTechLett,2005,11(4):415-420.⑵ENOKIT,SAGAWAH,TOMINAGAT,etal.Drugs,foodsordrinkswiththeuseofalgae-derivedphysiologicallyactivesubstances:US,6475990[P].2002-11-05.XUECH,XUQ,ZHAOX,etal.Radicalscavengingabilityofagaroligomer[J].JFishChin(水產(chǎn)學(xué)報)，2003,27(3):283-288.CHENHM,YANXJ,ZHUP,etal.Antioxidantactivityandhepatoprotectivepotentialofagaro-oligosaccharidesinvitroandinvivo[J/OL].NutritionJournal,2006,5:31[2006-12-02].http:ZZ/content/5Z1/31.WANGQJ,CHENY,ZHUWY.TheImmuneEffectofFunctionalOligosaccharidesonAnimalOrganism[J].CerealFeedInd(糧食與飼料工業(yè))，2000,(6):35-36.MAZUMDERS,GHOSALPK,PUJOLCA,etal.Isolation,chemicalinvestigationandantiviralactivityofpolysaccharidesfromGracilariacorticata(Gracilariaceae,Rhodophyta)[J].IntJBiolMacromol,2002,31:87.LINZ,QIURR,PENGYY.AdvancesinAgarase[J]LfeSciRes(生命科學(xué)研究)，2006,10(2):62-66.LIUJT,CAIJP,WUB.ProgressofStudiesonAgaraseandItsApplications[J].ModFoodSciTechnol(現(xiàn)代食