深圳大學(xué)理科選修遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)7重組

深圳大學(xué)理科選修遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)7重組第1頁/共36頁第2頁/共36頁大腸埃希菌俗名大腸桿菌是人和動物腸道中最主要的細菌之一是正常菌群的成員出生后數(shù)小時就進入腸道，并伴隨終生能合成維生素B和K，供人體利用能抑制腐敗菌及病原菌（如金黃色葡萄球菌、志賀菌屬）真菌（如白念珠菌）的過度增殖異位寄居時可引起腸外感染某些菌株有致病性—消化道感染，導(dǎo)致腹瀉等每個人每天平均從糞便中排出1011到1013個可作為糞便污染的檢測指標常作為細菌的模式生物廣泛用于科學(xué)研究基因工程的工具菌第3頁/共36頁生物學(xué)性狀形態(tài)與染色G-

桿菌，1~3μm（短桿菌）兩端鈍圓、無芽孢有周鞭毛有普通菌毛/性菌毛能運動第4頁/共36頁衛(wèi)生細菌學(xué)檢查大腸菌群指37OC24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣包括埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬及腸桿菌屬等大腸菌群指數(shù)指1000ml被檢樣品中的大腸菌群數(shù)生活飲用水的水質(zhì)標準coli-index≤3個我國2007年開始實施的衛(wèi)生標準規(guī)定每100ml生活飲用水中，不得檢出總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希菌

第5頁/共36頁1、細菌培養(yǎng)--平板培養(yǎng)劃線法培養(yǎng)涂布法培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)第6頁/共36頁限制性內(nèi)切酶EcoRI內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀第7頁/共36頁沃納?阿爾伯1929年生于瑞士。蘇黎士工科大學(xué)畢業(yè)后，在日內(nèi)瓦大學(xué)獲得博士學(xué)位。1971年起，任巴塞爾大學(xué)教授。在研究噬菌體的遺傳現(xiàn)象時，成功地分離出DNA的限制性酶和甲基化修飾酶，為此獲1978年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎。第8頁/共36頁限制—修飾現(xiàn)象Kλ（B）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長受寄主限制Kλ（K）存活下來的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制第9頁/共36頁EOP:Efficiencyofplating（生長在不同寄主中的λ噬菌體的成斑率，表示限制程度）說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA；10-4的存活率是由宿主限制系統(tǒng)作用的結(jié)果第10頁/共36頁產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因何在甲基化酶：能使細胞自身核酸的內(nèi)切酶識別序列的堿基甲基化，從而使自身核酸免受內(nèi)切酶水解——細菌的“防御”系統(tǒng)核酸內(nèi)切酶：識別并水解外源DNA（外來核酸在內(nèi)切酶識別序列上沒有甲基化修飾作保護）研究發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶限制修飾第11頁/共36頁限制—修飾體系Kλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體Kλ（K）再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對其進行了修飾）λ（B）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，其DNA大部分被內(nèi)切酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。第12頁/共36頁在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型的細菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA（如噬菌體DNA等），使得外源DNA對生物細胞的入侵受到限制；

而宿主細胞自身的DNA分子合成后，通過修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義。限制—修飾體系，其功能就是保護自身的DNA，分解外來的DNA，以保護和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定，這對細菌的生存和繁衍具有重要意義。第13頁/共36頁分類核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸酶從核酸鏈的一端開始，一個接一個地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔研纬尚∑魏怂醿?nèi)切酶：按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類（I，II，III），通常指的是II型。

第14頁/共36頁命名法HindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶如從流感嗜血桿菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后發(fā)現(xiàn)3種限制性酶，則分別命名為HindI，HindII，HindIII大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型號）種名的頭兩個字母宿主屬名的第一個字母coli前3個字母代表來源的生物隨后1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株最后1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序

第15頁/共36頁基本特征識別并切割雙鏈DNA（環(huán)狀或線狀）分子中4-8bp的特定序列結(jié)構(gòu)特征：旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)切割后產(chǎn)生的末端：CohesiveterminusorBluntend（粘性末端或平末端）EcoRI的識別序列5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的切割位點第16頁/共36頁質(zhì)粒質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1~200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。第17頁/共36頁萊德伯格（1925~2008），美國遺傳學(xué)家。細菌遺傳學(xué)的創(chuàng)始人之一。1925年5月23日生于美國蒙特克萊市。1944年獲哥倫比亞大學(xué)學(xué)士學(xué)位，以后曾在醫(yī)學(xué)院學(xué)習(xí)，不久轉(zhuǎn)入耶魯大學(xué)，于1947年獲博士學(xué)位。1959年起任斯坦福醫(yī)學(xué)院教授兼遺傳學(xué)系主任。1962年任肯尼迪分子醫(yī)學(xué)實驗室主任。他在耶魯大學(xué)期間，發(fā)現(xiàn)細菌的遺傳重組。1946年，他和E.L.塔特姆發(fā)現(xiàn)遺傳重組的普遍性。1952年發(fā)現(xiàn)細菌的F因子。1952年發(fā)現(xiàn)沙門氏菌中的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，1953年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的溫和噬菌體λ在染色體上占有一定位置。1956年發(fā)現(xiàn)λ噬菌體能進行局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。他們的研究工作還包括應(yīng)用細菌的有性生殖和轉(zhuǎn)導(dǎo)進行細菌的免疫學(xué)和代謝作用等方面的研究。

1958年他和G.W.比德爾和E.L.塔特姆共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。第18頁/共36頁接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)接合：指通過細菌細胞的直接接觸，遺傳物質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移到受體并發(fā)生重組的過程。1946年萊德伯格和塔特姆發(fā)現(xiàn)了細菌的接合。第19頁/共36頁細菌的雜交實例（1946）不同營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌（K12）：A菌株：met-bio-thr+leu+thi+，B菌株：met+bio+thr-leu-thi-

第20頁/共36頁這種野生型細胞如何出現(xiàn)的？U型管實驗：A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合結(jié)果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長出野生型細菌。結(jié)論：菌株A與菌株B細胞直接接觸（接合）是野生型細胞出現(xiàn)的必要條件；兩菌株直接接觸后導(dǎo)致遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移，進而發(fā)生基因重組，產(chǎn)生野生型細菌。第21頁/共36頁試驗證明：接合過程是一種單向轉(zhuǎn)移，A菌株遺傳物質(zhì)

B菌株，從供體到受體。用大腸桿菌K12的菌株A和菌株B，首先用高劑量的鏈霉素處理菌株A或菌株B，把處理過的菌株A跟未處理過的菌株B混合，或把處理過的菌株B跟未處理過的菌株A混合，發(fā)現(xiàn)結(jié)果大不相同：第22頁/共36頁⑴F因子：致育因子或稱性因子，是一種附加體。攜帶F因子的菌株稱為供體菌或雄性，用F＋表示。未攜帶F因子的菌株為受體菌或雌性，用F－表示。F因子及F＋向F－的轉(zhuǎn)移⑵F因子的結(jié)構(gòu)染色體外遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒），環(huán)狀DNA，9×104bp，大約為大腸桿菌環(huán)狀染色體的2%，具有40~60個蛋白質(zhì)基因。每個細胞（F＋）有2~4個。第23頁/共36頁F因子分為三個區(qū)域：自主復(fù)制區(qū)：有轉(zhuǎn)移的起點和2個復(fù)制起點。復(fù)制起點OriT是在染色體轉(zhuǎn)移時進行滾環(huán)復(fù)制時的復(fù)制起點；OriV是在營養(yǎng)時期，即游離在細胞質(zhì)中獨立復(fù)制時的復(fù)制起點。轉(zhuǎn)移區(qū)：主要有合成性傘毛即F纖毛（Fpili）的操縱子。F纖毛是由性傘毛蛋白構(gòu)成，呈管狀，又叫接合管。通過接合管可將供體和受體細胞相聯(lián)。共30kb長，有40個基因與DNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)。重組區(qū)：有4個插入順序（IS），通過和宿主染色體上的IS同源重組或通過轉(zhuǎn)座，F(xiàn)因子可以整合到宿主不同位點上。第24頁/共36頁⑶F因子的三種狀態(tài)②有一個自主狀態(tài)的F因子，即F＋細胞；

③帶有一個整合的F因子的細胞叫高頻重組細胞，Hfr細胞。①沒有F因子，即F－細胞；第25頁/共36頁

F＋與F－菌（1）有F因子的細菌稱為F＋，細菌增殖時可把F

因子傳遞給后代細胞（通過自主復(fù)制）。（2）沒有F因子的細菌稱為F－，F(xiàn)＋細菌經(jīng)吖啶橙處理而丟失，成為F－。F因子一經(jīng)丟失，細胞中便不再出現(xiàn)；（3）F＋可以和F－雜交，而不能和F＋雜交；（4）F＋菌與F－菌混合（即F＋×F－）1小時后，約95%的F－菌轉(zhuǎn)變?yōu)镕＋菌，而原來的F＋仍然保留有F因子。第26頁/共36頁(1)F纖毛合成：由性傘毛蛋白構(gòu)成，接合管使供體和受體細胞接觸。(2)轉(zhuǎn)移啟動：F因子從轉(zhuǎn)移復(fù)制起點(OriT)開始向F

－轉(zhuǎn)移（5’端首先進入受體）。(3)單鏈轉(zhuǎn)移，滾環(huán)復(fù)制。F纖毛與接合管F＋×F－第27頁/共36頁Hfr是F因子整合到E.coli

染色體上的結(jié)果E.coli染色體上有20個以上的整合位點；整合通過IS等同源重組或轉(zhuǎn)座實現(xiàn)；F因子有多個整合位點，主要在IS3處。第28頁/共36頁分子克隆第29頁/共36頁pUC18pUC19含四個部分：（1）來自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點（ori）；（2）ampr;（3）大腸桿菌β半乳糖苷酶基因（lacZ’）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列；（4）多克隆位點（MCS）lacZ`OriAmprMCS第30頁/共36頁藍白斑篩選重組子的原理：

lacZ’編碼β半乳糖苷酶的α肽，在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）被分解產(chǎn)生藍色。因此攜帶空載體的大腸桿菌呈藍色菌落。外源基因的插入使α肽失活，因而攜帶外源基因的重組子菌落呈白色。第31頁/共36頁利用菌落顏色篩選重組子第32頁/共36頁PUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點：基因組小，拷貝數(shù)高，DNA產(chǎn)量高；有LacZ篩選標記，LacZ基因插入失活，可用藍白斑篩選陽性克??；有MCS，其中有13個以上的單一限制位點，可用于外源基因克隆。第33頁/共36頁意義與應(yīng)用

重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用開辟了分子遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門。它的成就對于工