第五節(jié)食品中維生素類的分析

第五節(jié)食品中維生素類的分析第1頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一一、水溶性維生素類的測定

（一）理化性質(zhì)

水溶性維生素都易溶于水，不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在加熱情況下，可大部或全部破壞。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響，如維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化。

所以測定水溶性維生素一般都在酸性溶液中進(jìn)行前處理。第2頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（二）維生素B族的測定

維生素B1、B2通常采用稀鹽酸水解，或再經(jīng)淀粉酶、木瓜蛋白酶酶解，使結(jié)合態(tài)維生素游離出來，再進(jìn)行提取。為了去除雜質(zhì)，可用活性人造浮石、硅鎂吸附劑等進(jìn)行純化處理。

第3頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一1、維生素B1的測定

（1）硫色素?zé)晒夥ǎ簢鴺?biāo)法。

①原理：硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中能被氧化成一種強藍(lán)色熒光物質(zhì)—噻嘧色素（硫色素）。硫色素在紫外線照射下，發(fā)出熒光，其強度與硫色素濃度成正比，也即與溶液中硫胺素含量成正比。

激發(fā)波長365nm；發(fā)射波長435nm。

②樣品提?。簩τ谝话銟悠?、高蛋白樣品、淀粉質(zhì)樣品處理方法不同，如樣品中所含雜質(zhì)較多，可用柱層析法處理，使硫胺素與雜質(zhì)分離，然后以所得溶液作測定。第4頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

操作過程：

試樣勻漿或粉碎，稱樣于三角瓶中——加稀鹽酸，放入高壓鍋中加熱水解——加淀粉酶、蛋白酶酶解，過濾得提取液——將提取液加入已準(zhǔn)備好的鹽基交換柱中，過柱——熱蒸餾水沖洗交換柱，去雜質(zhì)——熱酸性氯化鉀過柱，收集濾液，即為試樣凈化液——凈化液分別加入A、B兩個反應(yīng)瓶——避光，A瓶中加入氫氧化鈉溶液，B瓶中加入堿性鐵氰化鉀溶液，振搖15s——加10mL正丁醇，同時振搖1.5min，靜置分層——吸去下層堿性溶液，加無水硫酸鈉使溶液脫水——上機(jī)測定。第5頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第6頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第7頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（2）高效液相色譜法

待測樣品色譜方式檢測器

肉及肉制品正相液相色譜熒光檢測器

米粉反相鍵合相色譜柱后衍生化后

熒光檢測器

食品離子交換色譜紫外檢測器

米及米制品反相離子對色譜紫外檢測器第8頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.84-2003食品中硫胺素(維生素B1)的測定.pdf第9頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

2、維生素B2的測定

國標(biāo)第一法為熒光法，第二法為微生物法。

（1）熒光分光光度法

原理：樣品經(jīng)酸解、酶解處理使核黃素游離出來，用高錳酸鉀和過氧化氫氧化雜質(zhì)，再經(jīng)硅鎂吸附劑進(jìn)行柱層析，吸附提取核黃素，最后用洗脫液——丙酮＋冰乙酸＋水洗脫并收集核黃素。VB2水溶液呈黃綠色熒光，在440nm的激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長處可產(chǎn)生最大熒光強度。

測定谷物中VB2時最好在樣品酸解后，加入一定量的淀粉酶，在35～40℃酶解15小時左右，這樣有利于結(jié)合型的VB2轉(zhuǎn)化成游離型的VB2

。第10頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（2）高效液相色譜法

待測樣品色譜方式檢測器

食品反相鍵合相色譜熒光檢測器

肉及肉制品正相液相色譜熒光檢測器

蛋及奶制品反相鍵合相色譜紫外檢測器

米及米制品反相離子對色譜紫外檢測器第11頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

3、維生素B5的測定

國標(biāo)方法為微生物法。

（1）溴化氰比色法

VB5與溴化氰結(jié)合后可與對氨基苯乙酮（或其它芳香族胺）作用生成黃色化合物，因而可在420nm波長處測定光密度，求出VB5的含量。

（2）氣相色譜法

煙酸分子具有羥基，不溶于有機(jī)溶劑，不能直接用氣相色譜法進(jìn)行測定，但煙酸經(jīng)酯化轉(zhuǎn)變成煙酸乙酯或N—2基煙酰胺之后，可以用氣相色譜法進(jìn)行分離測定。

（3）高效液相色譜法

利用酸水解法提取VB5，經(jīng)高效液相色譜分離，測定。第12頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

4、維生素B6的測定

國標(biāo)法為微生物法。

（1）熒光分析法

樣品經(jīng)硫酸加壓水解，采用CGS樹脂的柱層析分離，以氯化鉀的磷酸緩沖液洗脫。洗脫液在二氧化錳和乙醛酸鈉溶液存在下，可使VB6的混合物即吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺一次轉(zhuǎn)化為吡哆醛。吡哆醛在氰化鉀作用下生成強熒光物質(zhì)—吡哆醛氰醇衍生物。在激發(fā)波長355nm，發(fā)射波長434nm處，測定其熒光強度，就可計算出樣品中VB6的含量。第13頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（2）氣相色譜法

VB6與七氟丁基咪唑反應(yīng)可生成揮發(fā)性的衍生物，該衍生物在氣相色譜中可以很好地分離。最低檢出限10ng。

氣相色譜條件：電子捕獲檢測器；3%SE—52，固定相ChromosorbW—HPO

（3）液相色譜法

樣品水解后上機(jī)測定。

C18柱

熒光檢測器：激發(fā)波長290nm，發(fā)射波長395nm。第14頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

5、維生素B12的測定

（1）比色法

樣品用濃硫酸和高氯酸鉀消化后，樣品中的鈷與M—α—吡啶聯(lián)腙生成鈷的紅色化合物，可以進(jìn)行比色測定，再從鈷的含量換算成VB12的含量。

注意：樣品中存在游離鈷離子將使測定結(jié)果偏高，可以預(yù)先用8—羥基奎寧—氯仿溶液提取，分離除去。

（2）原子吸收分光光度法

維生素B12的分子中含有鈷離子，占VB12的4.35%，采用原子吸收分光光度法可以測定其鈷含量，再換算成VB12的含量。第15頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

樣品預(yù)處理：

樣品用VB12提取液（無水磷酸氫二鈉1.3g＋檸檬酸1.2g＋無水焦亞硫酸鈉1.0g加水至100ml）提取，濾液中加入EDTA，用氨水調(diào)pH至7，再加入活性炭，振搖，用無灰濾紙過濾，VB12被吸附在活性炭上，將活性炭連同濾紙一起在600℃下灰化完全，用硝酸將殘渣溶解，以原子吸收分光光度法測定鈷的含量。

從鈷換算為VB12的換算系數(shù)=22.99。第16頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.217-2008保健食品中維生素B12的測定.pdf第17頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.210-2008食品中泛酸的測定.pdf第18頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.211-2008食品中葉酸的測定.pdf第19頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一文章\高效液相色譜法測定蔬菜中B族維生素.pdf第20頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（三）維生素C的測定

在食品中VC有三種存在形式：

還原型抗壞血酸（－2H，氧化）脫氫型抗壞血酸二酮古洛糖酸。

1、提取方法

食品中的維生素C通常采用草酸、草酸－醋酸、偏磷酸－醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對維生素C的破壞作用。草酸對維生素C有很好的穩(wěn)定性能；偏磷酸能沉淀蛋白質(zhì)，澄清提取液，適合于蛋白質(zhì)含量較高的樣品。第21頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一2、還原型抗壞血酸的測定

（1）分光光度法

在乙酸溶液中，抗壞血酸與固藍(lán)鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼-2-羥基丁酰內(nèi)酯衍生物。在最大吸收波長420nm處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。

非蛋白性樣品在乙酸溶液中提取，過濾后上清液供測定；蛋白性樣品需再加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液，沉淀蛋白質(zhì)。第22頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（2）2,6—二氯靛酚滴定法

還原型抗壞血酸可以還原染料2,6—二氯靛酚。該染料在酸性溶液中呈粉紅色，被還原后成無色溶液。在終點時，過量的未被還原的染料在酸性溶液中呈粉紅色，因此，在滴定過程中當(dāng)溶液從無色轉(zhuǎn)變成微紅色時，表示還原型抗壞血酸全部被氧化為脫氫抗壞血酸，此時即為滴定終點。第23頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一3、總抗壞血酸的測定

（1）熒光法：

國標(biāo)第一法。

樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成有熒光的喹喔啉衍生物，其熒光強度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定食品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。

激發(fā)光波長338nm，發(fā)射波長420nm。第24頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

當(dāng)食物中含有丙酮酸時，也與鄰苯二胺反應(yīng)生成一種熒光物質(zhì)，干擾測定。這時加入硼酸。硼酸與脫氫抗壞血酸結(jié)合生成硼酸脫氫抗壞血酸螯合物，此螯合物不能與鄰苯二胺反應(yīng)生成熒光物質(zhì)；而硼酸不與丙酮酸反應(yīng)，丙酮酸仍可發(fā)生上述反應(yīng)。因此，加入硼酸后測出的熒光值即為空白的熒光值。

注意事項：

試樣用偏磷酸-乙酸溶液提?。?/p>

活性炭加入量要適量，量過多，對抗壞血酸有吸附作用，使結(jié)果偏低；

空白氧化液中加入硼酸溶液后需在4℃冰箱中放置2-3h，使反應(yīng)完全，否則本底偏高。第25頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（2）2,4—二硝基苯肼比色法：

國標(biāo)第二法。

樣品中VC用草酸提取，活性炭使提取液中還原型抗壞血酸氧化成為脫氫抗壞血酸，然后與2,4—二硝基苯肼作用生成紅色的脎。在85％硫酸溶液的脫水作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)榻奂t色的無水化合物—雙-2,4二硝基苯。最大吸收波長500nm，吸光度與總抗壞血酸的總量成正比，進(jìn)行定量分析。第26頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一文章\獼猴桃中維生素C的高效液相色譜分析.pdf第27頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一二、脂溶性維生素類的分析測定

（一）理化性質(zhì)

1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。

2、耐酸堿性：維生素A、D對酸不穩(wěn)定，VE對酸穩(wěn)定。VA、D對堿穩(wěn)定，VE對堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下也能經(jīng)受堿的煮沸。

3、耐熱性、耐氧化性：VA、D、E耐熱性好；VA、E易氧化，光、熱能促進(jìn)氧化；VD不易被氧化。第28頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

根據(jù)上述性質(zhì)，測定脂溶性維生素時，通常先用皂化法處理樣品，水洗去除類脂物。然后用有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素（不皂化物），濃縮后溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲袦y定。為了防止氧化，常加入抗氧化劑。對于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。

操作在避光條件下進(jìn)行。

第29頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（二）維生素A的測定

1、比色法

國標(biāo)第二法。

維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻作用，生成藍(lán)色化合物，在波長620nm處有特異吸收。

適用于維生素A含量較高的樣品。

該法的主要缺點是生成的藍(lán)色絡(luò)合物的穩(wěn)定性差，比色測定必須在6s內(nèi)完成，否則藍(lán)色會迅速消退，造成極大誤差。第30頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

2、高效液相色譜法

國標(biāo)第一法。

（1）原理：

試樣中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取處理后，將其從不可皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用高效液相色譜C18反相柱將維生素A及維生素E分離，經(jīng)紫外檢測器檢測，并用內(nèi)標(biāo)法定量測定。

內(nèi)標(biāo)物：苯并[e]芘標(biāo)準(zhǔn)液

流動相：甲醇＋水（98＋2）

紫外檢測器：波長300nm

第31頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（2）樣品處理：

①皂化：準(zhǔn)確稱樣于皂化瓶中——加無水乙醇，攪勻——加抗壞血酸（抗氧化劑），加苯并[e]芘標(biāo)準(zhǔn)液（內(nèi)標(biāo)物）——加氫氧化鉀（1＋1）——于沸水浴回流30min，使皂化完全——立即放入冰水中冷卻。

②提?。涸砘镆迫敕忠郝┒贰右颐烟崛　獥壢ニ畬?。

③洗滌：用水洗乙醚層，至水層不顯堿性。

④濃縮：將乙醚提取液脫水（經(jīng)無水硫酸鈉過濾）后移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的球形蒸發(fā)瓶中——55℃水浴中減壓蒸餾——蒸發(fā)瓶中剩余2mL乙醚時，取下蒸發(fā)瓶，用氮氣吹干——加乙醇溶解提取物——離心，上清液供色譜分析。第32頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第33頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（三）維生素E的測定

1、比色法

維生素E與FeCl3反應(yīng)，F(xiàn)e3+被還原成Fe2+，F(xiàn)e2+可與—聯(lián)氮苯發(fā)生顏色反應(yīng)，呈紅色，因此在520nm處測定吸光度，可定量測定樣品中VE的含量。

2、GC法

3、HPLC法第34頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一維生素E測定的GC分析條件

化合物檢測器固定相檢測波長