核酸化學(xué)PCR2的資料

核酸化學(xué)PCR2的資料第1頁(yè)/共83頁(yè)20世紀(jì)40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA:

肺炎球菌第2頁(yè)/共82頁(yè)第2頁(yè)/共83頁(yè)20世紀(jì)50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制第3頁(yè)/共82頁(yè)第3頁(yè)/共83頁(yè)20世紀(jì)50年代末和60年代提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō)，并成功地破譯了遺傳密碼中心法則第4頁(yè)/共82頁(yè)第4頁(yè)/共83頁(yè)遺傳密碼64個(gè)密碼子

61個(gè)代表各種氨基酸（AUG起始密碼）

3個(gè)密碼子為終止子（UAA、UAG、UGA）第5頁(yè)/共82頁(yè)第5頁(yè)/共83頁(yè)操縱子

用基因表達(dá)調(diào)控的原理解釋了酶誘導(dǎo)的本質(zhì)第6頁(yè)/共82頁(yè)第6頁(yè)/共83頁(yè)核酸（nucleicacid)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)—貯存細(xì)胞所有的遺傳信息，是物種保持進(jìn)化和世代繁衍的物質(zhì)基礎(chǔ)核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)—參與蛋白合成的有3類(lèi)：第一節(jié)核酸化學(xué)概述信使核糖核酸(messengerribonucleicacid,mRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(transferribonucleicacid,tRNA)核糖體核糖核酸(ribosomeribonucleicacid,rRNA)第7頁(yè)/共82頁(yè)第7頁(yè)/共83頁(yè)嘧啶嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶腺嘌呤鳥(niǎo)嘌呤核苷酸核苷磷酸堿基戊糖脫氧戊糖核糖核苷酸(nucletide)第8頁(yè)/共82頁(yè)第8頁(yè)/共83頁(yè)DNARNA腺嘌呤（A）腺嘌呤（A）鳥(niǎo)嘌呤（G）鳥(niǎo)嘌呤（G）胞嘧啶（C）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）第9頁(yè)/共82頁(yè)第9頁(yè)/共83頁(yè)核苷中的戊糖5’碳原子上羥基被磷酸酯化第10頁(yè)/共82頁(yè)第10頁(yè)/共83頁(yè)11常見(jiàn)核苷酸名稱(chēng)第11頁(yè)/共82頁(yè)第11頁(yè)/共83頁(yè)12第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

第12頁(yè)/共82頁(yè)第12頁(yè)/共83頁(yè)13多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序（堿基）核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)第13頁(yè)/共82頁(yè)第13頁(yè)/共83頁(yè)14DNA中各脫氧核苷酸的排列順序四種脫氧的單核苷酸按照一定的順序以3’5’磷酸二酯鍵連接而形成的多核苷酸鏈

DNA的分子結(jié)構(gòu)（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)第14頁(yè)/共82頁(yè)第14頁(yè)/共83頁(yè)15

不同種生物DNA分子中的核苷酸排列順序不同(有種族特異性)同種生物不同組織器官細(xì)胞中DNA分子的核苷酸排列順序相同(無(wú)組織器官特異性)某一特定生物，其DNA堿基組成恒定任何生物DNA堿基組成都符合

A=T，G=C，A+G=T+CChargffLaw第15頁(yè)/共82頁(yè)第15頁(yè)/共83頁(yè)Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)學(xué)說(shuō)（doublehelixstructure）（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)維持DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素堿基對(duì)間氫鍵堿基的堆積力范氏引力疏水鍵正負(fù)電荷作用

第16頁(yè)/共82頁(yè)第16頁(yè)/共83頁(yè)17（三）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)—DNA鏈進(jìn)一步扭曲盤(pán)旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)第17頁(yè)/共82頁(yè)第17頁(yè)/共83頁(yè)一條DNA的長(zhǎng)鏈經(jīng)過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)即形成核小體后,其長(zhǎng)度被壓縮了7倍二級(jí)結(jié)構(gòu),即形成螺旋管后,DNA長(zhǎng)度又被壓縮了6倍三級(jí)結(jié)構(gòu),即由螺線管形成超螺線管后,DNA的長(zhǎng)度在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上被壓縮了40倍在由三級(jí)到四級(jí)結(jié)構(gòu),即形成染色單體后,DNA的長(zhǎng)度在三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上被壓縮了5倍（四）DNA的四級(jí)結(jié)構(gòu)第18頁(yè)/共82頁(yè)第18頁(yè)/共83頁(yè)19TypesofRNA第19頁(yè)/共82頁(yè)第19頁(yè)/共83頁(yè)20mRNA的結(jié)構(gòu)占細(xì)胞中總RNA的１%-５%不均一分子有編碼序列與非編碼序列第20頁(yè)/共82頁(yè)第20頁(yè)/共83頁(yè)５’端：翻譯起始序列;３’端：翻譯終止序列少量的間隔序列無(wú)帽無(wú)尾原核生物mRNA的結(jié)構(gòu)第21頁(yè)/共82頁(yè)第21頁(yè)/共83頁(yè)真核生物成熟mRNA結(jié)構(gòu)５’端帽子結(jié)構(gòu):經(jīng)甲基化修飾,以5’,5’-磷酸二酯鍵相連的GTP.(m7G5’ppp5’Np)

功能：與蛋白質(zhì)合成起始及保護(hù)mRNA不易被降解有關(guān)３’端尾結(jié)構(gòu)３’端：20-250個(gè)多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)（polyA）。polyA不是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物功能：穩(wěn)定mRNA第22頁(yè)/共82頁(yè)第22頁(yè)/共83頁(yè)23TypesofRNA第23頁(yè)/共82頁(yè)第23頁(yè)/共83頁(yè)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的發(fā)現(xiàn)目的：1990年美國(guó)人納波里利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一種催生紅色素的CHS基因插入牽牛花中，期望得到更艷麗的花朵ThePlantCell,2,279-289,1990結(jié)果：原來(lái)開(kāi)紫花的花色沒(méi)有加深，花瓣變成了白色，或雜色第24頁(yè)/共82頁(yè)第24頁(yè)/共83頁(yè)25Double-strandedRNAinjectsenseantisense1998年，AndrewFire等首次將正義鏈反義鏈RNA混合注入線蟲(chóng)C.elegans中，觀察到更強(qiáng)的基因表達(dá)抑制。首次提出了RNAinterference的概念第25頁(yè)/共82頁(yè)第25頁(yè)/共83頁(yè)26Acontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNAMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization第26頁(yè)/共82頁(yè)第26頁(yè)/共83頁(yè)272000年，RNA的研究進(jìn)展被美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)為重大科技突破2001年“RNA干擾”作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”2002年12月20日，Science雜志將“SmallRNA&RNAi”評(píng)為2002年度最耀眼的明星。Nature雜志亦將SmallRNA評(píng)為年度重大科技成功之一2003年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位第27頁(yè)/共82頁(yè)第27頁(yè)/共83頁(yè)28第28頁(yè)/共82頁(yè)第28頁(yè)/共83頁(yè)29第29頁(yè)/共82頁(yè)第29頁(yè)/共83頁(yè)第30頁(yè)/共82頁(yè)第30頁(yè)/共83頁(yè)31微RNA（microRNA,miRNA）第31頁(yè)/共82頁(yè)第31頁(yè)/共83頁(yè)32PrecursorofmiRNADicerantisensemiRNAmiRNPLin-4抑制mRNA的翻譯

ThemechanismofmiRNAsilencing分解mRNAGrisbok,Pasquinelli.Cell,106:23-34,2001.第32頁(yè)/共82頁(yè)第32頁(yè)/共83頁(yè)一、核酸的大小

DNA：人單倍體細(xì)胞中為2.9109bpRNA：分子較小第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)二、核酸的水解1、化學(xué)法

低pH發(fā)生磷酸二酯鍵水解高pHRNA的磷酸酯鍵易被水解，DNA則不易被水解2、酶法①按底物專(zhuān)一性：

核糖核酸酶（RNase）、脫氧核糖核酸酶（DNase）②按對(duì)底物作用方式

核酸外切酶：5’3’外切酶、3’5’外切酶核酸內(nèi)切酶：多核苷酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵第33頁(yè)/共82頁(yè)第33頁(yè)/共83頁(yè)34核酸外切酶：5’3’外切酶3’5’外切酶

5’

…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’

…

A-C-T-T-A-A-G-C…5’第34頁(yè)/共82頁(yè)第34頁(yè)/共83頁(yè)35核酸內(nèi)切酶：多核苷酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵5’

…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5’

…

G-C-T-G-3’5’-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-5’3’-G-C-T-C…5’第35頁(yè)/共82頁(yè)第35頁(yè)/共83頁(yè)36１、變性（denaturation）三、核酸的變性、復(fù)性與雜交第36頁(yè)/共82頁(yè)第36頁(yè)/共83頁(yè)37解鏈曲線（熔解曲線，meltingcurve）融解溫度meltingtemperature(Tm)

—在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度第37頁(yè)/共82頁(yè)第37頁(yè)/共83頁(yè)2、核酸的復(fù)性(renaturation)（退火，annealing）變性DNA經(jīng)過(guò)一定處理重新形成雙螺旋的過(guò)程

影響復(fù)性速度的因素：

DNA濃度

DNA片段的大小

DNA片段復(fù)雜性

合適的復(fù)性溫度

適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度

第38頁(yè)/共82頁(yè)第38頁(yè)/共83頁(yè)3、雜交（hybridization）兩條來(lái)源不同，但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對(duì)原則復(fù)性形成一個(gè)雜交體，這個(gè)過(guò)程即雜交，或稱(chēng)分子雜交第39頁(yè)/共82頁(yè)第39頁(yè)/共83頁(yè)第二部分聚合酶鏈反應(yīng)

(PolymeraseChainReaction,PCR)第40頁(yè)/共82頁(yè)第40頁(yè)/共83頁(yè)1985年美國(guó)PE-cetus公司人類(lèi)遺傳研究室的Karymullis發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的PCR技術(shù)1988年

美國(guó)PE-cetus公司推出世界上第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR反應(yīng)自動(dòng)化1993年

KaryMullis因發(fā)明PCR技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1995年定量PCR儀誕生，使定量研究DNA靶序列成為現(xiàn)實(shí)PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展第41頁(yè)/共82頁(yè)第41頁(yè)/共83頁(yè)42PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程（一）DNA的體外復(fù)制的步驟：變性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）

模板DNA引物4種脫氧核糖核苷酸DNA聚合酶其他（二）PCR基本組成：第42頁(yè)/共82頁(yè)第42頁(yè)/共83頁(yè)43DNA體內(nèi)復(fù)制半保留復(fù)制

（semiconservativereplication）第43頁(yè)/共82頁(yè)第43頁(yè)/共83頁(yè)44DNA的體外復(fù)制第44頁(yè)/共82頁(yè)第44頁(yè)/共83頁(yè)靶序列靶序列靶序列靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’第45頁(yè)/共82頁(yè)第45頁(yè)/共83頁(yè)靶序列靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第46頁(yè)/共82頁(yè)第46頁(yè)/共83頁(yè)30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第47頁(yè)/共82頁(yè)第47頁(yè)/共83頁(yè)48PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示第48頁(yè)/共82頁(yè)第48頁(yè)/共83頁(yè)49PCR演示第49頁(yè)/共82頁(yè)第49頁(yè)/共83頁(yè)50指數(shù)增長(zhǎng)期線形增長(zhǎng)期平臺(tái)期循環(huán)數(shù)#

理論值

實(shí)際值Log產(chǎn)物DNAPCR過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)第50頁(yè)/共82頁(yè)第50頁(yè)/共83頁(yè)第51頁(yè)/共82頁(yè)第51頁(yè)/共83頁(yè)AFTER1CYCLE

100% =2.00x

90% =1.90x

80%=1.80x

70%=1.70x

第52頁(yè)/共82頁(yè)第52頁(yè)/共83頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式以PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物，mRNA3’末端polyA尾與之互補(bǔ)以人工合成的隨機(jī)序列（6bp)混合物作為引物第53頁(yè)/共82頁(yè)第53頁(yè)/共83頁(yè)DNA鏈中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基團(tuán)，在DNA合成、鏈的延長(zhǎng)過(guò)程中，新?lián)饺氲拿撗鹾塑账?’-p與前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯鍵相連Sanger法是在反應(yīng)體系中加入2’,3’-ddNTP，由于其沒(méi)有3’-OH而不能與下一個(gè)核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止雙脫氧鏈終止法（Sanger法）DNA序列分析

第54頁(yè)/共82頁(yè)第54頁(yè)/共83頁(yè)第55頁(yè)/共82頁(yè)第55頁(yè)/共83頁(yè)56設(shè)計(jì)沙眼衣原體引物（Chlamydiatrachomatis，CT）確定擬要研究的基因:CTGenbank中找到相應(yīng)的基因序列

采用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)/確保引物的特異性，將設(shè)計(jì)好的序列在

www.ncbi.nlm.nih/blast中核實(shí)第56頁(yè)/共82頁(yè)第56頁(yè)/共83頁(yè)第三部分實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)第57頁(yè)/共82頁(yè)第57頁(yè)/共83頁(yè)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR技術(shù)

對(duì)PCR擴(kuò)增的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物定量分析第58頁(yè)/共82頁(yè)第58頁(yè)/共83頁(yè)59實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高可直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量解決PCR污染問(wèn)題自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單第59頁(yè)/共82頁(yè)第59頁(yè)/共83頁(yè)P(yáng)CR即每個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增子增加一倍。然而到了一定時(shí)候，原料和酶相對(duì)于模板大大減少，PCR的效率就會(huì)降低，直至為0。所以實(shí)際的擴(kuò)增曲線是“S”型的，而不是“J”型理想：J型，2N

方程實(shí)際：S型不可檢測(cè)期指數(shù)期平臺(tái)期RealtimePCR同樣不能直接測(cè)出初始DNA的分子數(shù),但采用的數(shù)據(jù)是在PCR中期，比末期定量要準(zhǔn)確（更接近理想情況）第60頁(yè)/共82頁(yè)第60頁(yè)/共83頁(yè)61常用的熒光定量PCR方法SYBRGreenITaqman水解探針?lè)肿有艠?biāo)第61頁(yè)/共82頁(yè)第61頁(yè)/共83頁(yè)SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位只有與雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光SYBR與dsDNA結(jié)合，并且受到激發(fā)的時(shí)候，可以發(fā)出綠色熒光第62頁(yè)/共82頁(yè)第62頁(yè)/共83頁(yè)SYBRGreenI工作原理未結(jié)合的SYBRgreenI第63頁(yè)/共82頁(yè)第63頁(yè)/共83頁(yè)SYBRGreenI工作原理第64頁(yè)/共82頁(yè)第64頁(yè)/共83頁(yè)SYBRGreenI的特點(diǎn)可以用于不同的模板使用方便，價(jià)格相對(duì)便宜靈敏度很高與非特異性產(chǎn)物結(jié)合融解曲線選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反應(yīng)條件第65頁(yè)/共82頁(yè)第65頁(yè)/共83頁(yè)第66頁(yè)/共82頁(yè)第66頁(yè)/共83頁(yè)TaqManProbes熒光素淬滅劑

與目標(biāo)序列互補(bǔ)FAMTETJOEHEXTAMRATaqMan探針的機(jī)理DNA聚合酶在延伸階段將探針切碎，使熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分開(kāi)，于是熒光得以檢測(cè)第67頁(yè)/共82頁(yè)第67頁(yè)/共83頁(yè)第68頁(yè)/共82頁(yè)第68頁(yè)/共83頁(yè)第69頁(yè)/共82頁(yè)第69頁(yè)/共83頁(yè)第70頁(yè)/共82頁(yè)第70頁(yè)/共83頁(yè)TaqManProbes工作原理

光能量轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團(tuán)

淬滅劑

延伸時(shí)，Taq酶水解探針，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離而發(fā)出熒光，形成熒光信號(hào)Taq發(fā)出熒光光另一波長(zhǎng)的熒光第71頁(yè)/共82頁(yè)第71頁(yè)/共83頁(yè)分子信標(biāo)(發(fā)夾型雜交探針)熒光基團(tuán)莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)

淬滅劑莖(5-7bp)

環(huán)（15-30bp）FAMTexasRed第72頁(yè)/共82頁(yè)第72頁(yè)/共83頁(yè)分子信標(biāo)工作原理探針與DNA模板雜交光發(fā)出熒光熒光基團(tuán)DNA模板淬滅劑莖環(huán)光第73頁(yè)/共82頁(yè)第73頁(yè)/共83頁(yè)Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)與模板數(shù)成正比固定熒光信號(hào)值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比初始DNA量越多,熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少起始模板的對(duì)數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量Threshold104103102第74頁(yè)/共82頁(yè)第74頁(yè)/共83頁(yè)定量PCR相對(duì)定量提供一種在不需要知道目的基因具體量時(shí),一種有效的比較樣本間RNA或DNA水平的方法大多數(shù)情況下是比較處理組與未處理組，或者正常組織與病變細(xì)胞或組織的mRNA水平的差別對(duì)于多數(shù)基因表達(dá)研究來(lái)說(shuō)，對(duì)某一樣本中目的基因進(jìn)行絕對(duì)定量并不是必須；與參考樣本相比基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)的水平已