HPLC原理和操作詳解

HPLC原理和操作詳解藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表：79一、液相色譜理論發(fā)展簡況親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流色譜法最早是由俄國植物學家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分法。璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長(常有幾個小時)。高C。容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組LC法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體(界于氣體和液體之間的一種物相)為流動相(常用CO2)，因其擴散系數(shù)大，能很快達到排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法。(此外還有電泳。) (正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過~10μm。適用于分離分子量2．液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解配平衡過程。動相必須預先用固定相飽和，以減少溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學鍵合固定正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷)，常加入乙醇、異極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。反相色譜法一般用非極性固定相(如C18、C8)；流動相為水或緩沖液，隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液 (2~8)，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有高~中低~中中~低中~高譜法與反相色譜法沒有明顯的界線 (如氨基鍵合固定相)。成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電行可逆交換，根據(jù)。組分在離子交換柱中的保留4．離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被離子對化合物后，在非極性固定相中對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸。離子對色譜法常用ODS柱(即C18)，流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多σ不斷被洗脫出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線(高斯k的起點至終點的距離。峰高的倍處。標準偏差的大小說明組分在流W2．定性參數(shù)(保留值)死時間(deadtime，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相(溶劑)固定m相顆粒間隙(被流動相占據(jù)，V)、柱出口管路體積、檢測器流動池體mRRRRtR質，因此，t'R(或tR)可用于定性。離效率(簡稱柱效)。N取決于固定相的種類、性質(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態(tài)分算更為方便和常用，因為半峰寬更易準注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。(一般HPLC柱的N在1000以數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(Cs、pHk上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間(t'R)是不保留組分保留時間(t0)的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在留時間(《美國藥典》)?；痉蛛x方程——分離度與三個色譜基本參數(shù)有如下關系：柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：1)色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔(即塔板高度)內(nèi)完全服從量無關。，很難達可避免的。但是塔板理論導出了形狀、濃度極大點的位置，能夠2．色譜流出曲線方程及定量參數(shù)(峰高h和峰面積A)曲線可用下述正態(tài)分布方程來描述：與組分的量C0(進樣量)成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進三、速率理論(又稱隨機模型理論)把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬(即柱效)的影響。氣相色譜速率方程)的基礎上，根據(jù)液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程(即Giddings方程)：1)渦流擴散(eddydiffusion)。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結構不同，分大)，且會使柱壓過高。大而均勻(球形或近球形)的顆粒容易填充規(guī)則均2)分子擴散(moleculardiffusion)。又稱縱向擴散。由于進樣后溶質分子2γDm/u。u為流動相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時間越長(u小)，展寬越嚴D3)傳質阻抗(masstransferresistance)。由于溶質分子在流動相、靜態(tài)流中的傳質過程而導致的峰展寬。溶質分子在流動相和固定相中的使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜固定相的顆粒越小，微孔孔徑傳質速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態(tài)流動。Hs定從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措很小(大約~0.1mm/s)，在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說是柱內(nèi)峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因效應主要由低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內(nèi)腔體積應＜VR/。其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要柱外效應的直觀標志是容量因子k小的組分(如k＜2)峰形拖尾和峰寬增IIIHPLC統(tǒng)逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機、工司)、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器閥)，價格也較貴。各品牌輸液泵的基本參數(shù)：型~%型~%型求%：相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜(μm或μm)等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應經(jīng)常清洗這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水)。作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變相應該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障：流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量(如5ml/min)下運轉，將氣泡排盡，也可用一砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)內(nèi)迅速除去微生物，或將鹽相組成保持恒定，適合于組分數(shù)目較少，性質差別不大的樣一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離pH析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常梯度洗脫有兩種實現(xiàn)方式：低壓梯度(外梯度)和高壓梯度(內(nèi)梯度)。即有多種洗脫曲線：線性梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓入口處。現(xiàn)在大都使用六通進樣佳不易找到，常規(guī)分析使用受到限制?，F(xiàn)“鬼峰”；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信7725和7725i型最常見)，其關鍵部件由圓形密封墊(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進樣量準確，重復性好(%)，操作六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環(huán)體積的50%(最多75％)，并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環(huán)體減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉到進樣位分析結束后應沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，。有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術。即效的影響遠遠大于管壁效應。色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組小管壁效應，不銹鋼柱內(nèi)壁細管柱。色譜柱兩端的柱接柱(常量柱)，內(nèi)徑2~5mm(常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm)，柱長microcolumn)，內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱(又稱微柱。的微徑柱(microbore)。細管徑柱的優(yōu)點是：①節(jié)省流動相；②靈敏度增加；到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現(xiàn)LC-由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的根本問題還下 (樣品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使 (如前所述)。②應逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以④選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以避免固定相被破壞。有時可⑤避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進且應該經(jīng)常更換?；烊艿娜軇┲饾u過渡，每種流動相的體積應下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇(乙腈)沖洗時重復注射液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(%)梯度洗脫能除去蛋白質污染。除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的⑦保存色譜柱時應將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮⑧色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱 下降，這時也可補加填料使柱效LC變化不敏感)、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。1)按原理可分為光學檢測器(如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射)、熱學檢測器(如吸附熱)、電化學檢測器(如極譜、庫侖、安培)、電學檢測器(電導、介電常數(shù)、壓電石英頻率)、放射性檢測器(閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化)以及氫火焰離子化檢測器。2)按測量性質可分為通用型和專屬型(又稱選擇性)。通用型檢測器測量。濃度型檢測器的響應與流動相中組分4)檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。1)噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基測器，那么它們還反映流速 (泵的脈動)和溶劑(純度、含有氣泡、固定相流失)的影響。噪音和漂移都大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位3)檢測限(detectionlimit)檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(通常用2倍或3倍噪音表示)時進入檢測器的某組分的量(對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色種柱外因素引起的峰展寬有關。圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量(濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度)之比。也可用響應信號的最大與最小的范圍表示，例如Waters996定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關系。輸出信號與樣品量最好呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應。通x，度洗脫檢測等。幾種檢測器的主要性能：否小無有是無小難無是有大無UV是無小難無寬否無A＝lg＝lg＝ECL5)池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10μl。在l檢測系統(tǒng)帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心V 光路和雙光路兩種?？勺儾ㄩL檢測器又可分單波長(單通道)檢測器和雙波長 每個洗脫組分進行光譜掃描，經(jīng)計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性(確證是否是單一純物質)，色譜用于定量。常用于復雜樣品(如生物樣品、中草藥)的定性定量分析。1)流動池內(nèi)有氣泡果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會 池內(nèi)增壓，然后放開。可反復操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流2)流動池被污染池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移。可以使用適當3)光源燈出現(xiàn)故障常工作時，可能產(chǎn)生嚴異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更4)倒峰器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折指數(shù)低于流動相的折光指數(shù)，也會出現(xiàn)倒峰，這果流動相中含有紫外吸收的雜質，使用紫外檢測倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相能、流動相的粘度都有影響。一般來在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低對保留時間都有影響。在凝膠色譜填料結構的變化，對分離有影響；但如使用硬質填分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質(如緩沖劑)加入流動相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時溫度對保留值的影響很大。0.001C以內(nèi)。一、基質(擔體)合物基質硅膠④含碳量及表面覆蓋度(率)。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不2)氧化鋁膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動3)聚合物膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質于大分子量的被分析物質，主要用來制成分子排阻和離子交++苯+++++注：+++好++一般+差將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由于空間位阻效應(不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上)和其它因素的影響，使得大約有40~50%的響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質(特別是堿性化合物)產(chǎn)生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化(使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合般在鍵合反應后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端(或稱化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。應用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，并常?？筛纳品蛛x的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離被化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能規(guī)定了柱的長度，填料的種類和粒料分類也較詳細，這樣使色譜圖易于重現(xiàn)；而中國藥典僅規(guī)定填料種規(guī)定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現(xiàn)實驗，在某些情況下還浪征。選好填料(固定相)后，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜柱。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在V④粘度要低(應<2cp)。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱，如果要在相同的時間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑C＝0.32C2甲醇＋0.57C乙腈甲醇C＝0.66C四氫呋喃甲醇89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時，通H弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機胺(如三乙胺)又稱為減尾劑使無法檢測。(噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動)。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相(如烷基胺)反應。溶解氣體還會引起溶溶解氧能與某些溶劑(如甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收(特別是在260nm以下)，并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。在熒還原電化學法)，氧的影響更大。水混合液的脫氣是足夠了(一般500ml溶液需超聲20~30min方可)，此法不影高出水面太多。離線(系統(tǒng)外)脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體在線(系統(tǒng)內(nèi))脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體(通常是氦)將空氣替換出來。此外還氣體較頑固。在溶液中連續(xù)脫氣法在電化學檢測時經(jīng)常使用。但氦所有溶劑使用前都必須經(jīng)μm(或μm)濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外(除非在標簽上標明“已濾過”)。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相(脂溶性)濾膜和水相(水溶性)過濾水溶液時流速低或濾不動。水能貯存在塑料容應盡量新鮮配制