聚合酶鏈反應(yīng)及其相關(guān)技術(shù)詳解演示文稿

聚合酶鏈反應(yīng)及其相關(guān)技術(shù)詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四優(yōu)選聚合酶鏈反應(yīng)及其相關(guān)技術(shù)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性靈敏度高指數(shù)增長(zhǎng)，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平

簡(jiǎn)便、快速

2～4小時(shí)完成擴(kuò)增對(duì)標(biāo)本的純度要求相對(duì)較低DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程AmplificationofDNAinvitroincluding:變性（denaturation）:94C~95C

退火（annealing）:40C~70C

延伸（extension）:72C

三個(gè)步驟作為PCR的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份(principlecomponents):Template、Primers、dNTPTaqDNApolymeraseBuffer現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四模板(Template)基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，再以cDNA作為擴(kuò)增的模板模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四引物（Primers)

引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度，是化學(xué)合成的寡核苷酸片段?；瘜W(xué)合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循相關(guān)原則現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四設(shè)計(jì)引物的原則二條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應(yīng)平衡引物退火溫度計(jì)算：Tm℃=2(A+T)+4(C+G)引物的5’端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）引物濃度：0.1~0.2mol/L,濃度過(guò)高容易生成引物二聚體現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四Tmisdefinedasthetemperature

atwhich

halfthemoleculesaresingle-stranded現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四Effectof%GCContentonTm現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四Effectof[Salt]onTm現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四脫氧核苷三磷酸（dNTP）

dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致濃度過(guò)高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異性擴(kuò)增也隨之增加dNTP濃度：20~200mol/L,濃度升高增加非特異性擴(kuò)增現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四DNA聚合酶(DNApolymerase)從一種生活在熱泉水（80℃~90℃）中的水棲噬熱菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性Taq酶的作用:在模板指引下以dNTP為原料，在引物3’-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成最適酶量：1~2.5U（酶量過(guò)多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增）現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四TaqDNA聚合酶復(fù)制的保真性：TaqDNA聚合酶無(wú)3’→5’外切酶活性，因而無(wú)校正功能，在復(fù)制新鏈的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配TaqDNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，故擴(kuò)增片段越長(zhǎng)，錯(cuò)配的機(jī)率越高現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四耐熱的

DNA多聚酶PwoDNApolymerase、TthDNApolymerase、PfuDNApolymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿基錯(cuò)配率2~10倍現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四鎂離子濃度鎂離子濃度是一個(gè)至為關(guān)鍵的因素，對(duì)于穩(wěn)定反應(yīng)系統(tǒng)、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影響雖然Taq酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān)，但PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑的存在均可與Mg2+結(jié)合而降低游離Mg2+的濃度從而影響酶的活性當(dāng)dNTP濃度為200mol/L時(shí)，MgCl2的濃度為1.5mmol/L較宜?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四其它反應(yīng)因素

pH：調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需的最適pH（pH7.2左右）鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交基質(zhì)：BSA、gelatin、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護(hù)Taq酶的活性）現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR的反應(yīng)條件

反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四溫度

變性溫度：94℃~97℃退火溫度：低于引物Tm5℃左右溫度過(guò)高降低擴(kuò)增效率；溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度：72℃

此時(shí)Taq酶具有較高的酶促活性現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四時(shí)間

第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5~7分鐘）每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為30秒~1分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四循環(huán)次數(shù)

重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25～35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)：理論上PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但在擴(kuò)增25~35個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四指數(shù)增長(zhǎng)期平臺(tái)期循環(huán)數(shù)#

理論值

實(shí)際值Log產(chǎn)物DNAPCR的擴(kuò)增過(guò)程現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四平臺(tái)出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺(tái)出現(xiàn)得越早平臺(tái)效應(yīng)產(chǎn)生的因素：引物二聚體的產(chǎn)生、反應(yīng)產(chǎn)物、各組分的消耗和變性、引物和已擴(kuò)增的DNA片段間的競(jìng)爭(zhēng)等現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)定量PCR(quantitativePCR)實(shí)時(shí)PCR(realtimePCR)多重PCR(multiplexPCR)免疫PCRPCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變?cè)籔CR(insituPCR)現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針檢測(cè)RNA病毒、分析基因表達(dá)等現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式以隨機(jī)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物，mRNA3’末端polyA尾與之互補(bǔ)以人工合成的隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴(kuò)增現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四定量PCR對(duì)DNA或RNA樣本的靶序列進(jìn)行定量分析主要用于基因表達(dá)的分析、病原體核酸的檢測(cè)等在定量PCR反應(yīng)體系中，除了常規(guī)PCR反應(yīng)所需的材料和試劑外，還必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)（相對(duì)定量），因?yàn)槎喾N因素會(huì)影響最終產(chǎn)物量?jī)?nèi)參照系統(tǒng)一般選用與待測(cè)序列結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的基因，如-肌球蛋白基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)等現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四相對(duì)定量PCR通過(guò)凝膠電泳分析靶基因和內(nèi)參照的PCR產(chǎn)物量，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中靶基因的相對(duì)定量?jī)?nèi)參照基因一般選擇與靶基因序列無(wú)關(guān)的“管家基因”

這些基因的含量相對(duì)豐富，轉(zhuǎn)錄比較穩(wěn)定現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四

相對(duì)定量PCR設(shè)計(jì)相對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)方案時(shí)須注意：預(yù)先確定最佳模板量和PCR循環(huán)數(shù)，使所采用的各反應(yīng)參數(shù)在擴(kuò)增指數(shù)范圍內(nèi)，避免平臺(tái)效應(yīng)現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四相對(duì)定量RT-PCR將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA靶基因與“管家基因”同管擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四不同模板量時(shí)線性擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定模板量62.5~250ng時(shí)，27個(gè)循環(huán)內(nèi)為線性擴(kuò)增反應(yīng)期現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四不同循環(huán)次數(shù)時(shí)模板量的確定

62.5~250ng模板量至27個(gè)循環(huán)內(nèi)為線性擴(kuò)增現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四相對(duì)定量PCR管家基因與靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度應(yīng)不同，以使電泳能將兩者分離開(kāi)分別掃描管家基因和靶基因的條帶密度，二者之比即為靶基因擴(kuò)增條帶的相對(duì)密度分析各靶基因相對(duì)密度的變化現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四B-actin相對(duì)定量PCR現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四

相對(duì)定量PCR的優(yōu)勢(shì)與不足不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備和試劑即可以對(duì)靶基因進(jìn)行相對(duì)定量?jī)?nèi)對(duì)照系統(tǒng)無(wú)法排除參照基因本身表達(dá)變化的影響及參照基因和靶基因兩者擴(kuò)增效率不同等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行直接和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的實(shí)時(shí)定量分析實(shí)時(shí)PCR（realtimePCR）現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四熒光定量PCRfluorescencequantitativePCR,FQ-PCR是一種實(shí)時(shí)PCR，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)對(duì)PCR過(guò)程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，計(jì)算出PCR的初始模板量現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四技術(shù)原理DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）技術(shù)現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI染料，該染料能選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNA分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，結(jié)合的熒光信號(hào)和DNA含量成正比熒光信號(hào)的檢測(cè)在每一個(gè)循環(huán)的延伸期完成后進(jìn)行成本較低，無(wú)須對(duì)引物或探針進(jìn)行預(yù)先的熒光標(biāo)記，適用于任何反應(yīng)體系特異性不高，染料分子也會(huì)結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四FRET技術(shù)水解探針技術(shù)(hydrolizationprobe)技術(shù)雜交探針(hybridizationprobe)技術(shù)分子信標(biāo)(molecularbeacon)技術(shù)現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四TaqManTM技術(shù)原理5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四5’3’5’3’TaqManTM技術(shù)原理5’3’RQExtension

Step5’3’StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’CleavagePolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’

Detection5’3’3’QTaqR5’lR現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四臨床標(biāo)本實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增曲線現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四

RelativeFluorescencePCR產(chǎn)物的終點(diǎn)檢測(cè)現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四同一份標(biāo)本作96復(fù)管的測(cè)定結(jié)果現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四Lockeyetal.(1998)Biotechniques24:744-6終點(diǎn)檢測(cè)與實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的結(jié)果比較現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四CtCt值的概念

Ct值：擴(kuò)增曲線與基線交叉處的循環(huán)數(shù)(可以更為客觀地反映樣本中靶基因的初始拷貝數(shù))現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四定量PCR的外參照系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備制備標(biāo)準(zhǔn)品并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品與被檢樣本同時(shí)擴(kuò)增儀器軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依據(jù)被檢樣品的Ct值給出每一反應(yīng)中靶基因的拷數(shù)現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四r=實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)與所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性吻合度標(biāo)準(zhǔn)曲線現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CEA基因拷貝數(shù)在監(jiān)測(cè)胃腸癌微轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四

CEA基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌，尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá)，因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄本。在正常成人體內(nèi)極少表達(dá)。現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四正常成人體內(nèi)CEA基因表達(dá)狀況現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四胃腸癌腫瘤組織中CEA基因表達(dá)狀況現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四

在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時(shí)，外周血中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用靈敏、特異的技術(shù)檢測(cè)到這些腫瘤細(xì)胞中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵?，F(xiàn)在是63頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四胃腸癌患者外周血中CEA基因表達(dá)狀況現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四多重PCR(MultiplexPCR)

在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣本中多個(gè)不同序列的靶片段DMD基因外顯子缺失的檢測(cè)現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四差異顯示PCR

（differentialdisplayPCR,DD-PCR）一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是目前篩選基因表達(dá)差異比較有效的方法之一現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四

差異顯示RT-PCR(DifferentialdisplayRT-PCR)現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變(PCRmutagenesis)產(chǎn)物末端引入點(diǎn)突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變位點(diǎn)引入PCR產(chǎn)物（末端）現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR產(chǎn)物中間引入點(diǎn)突變EcoRIHindIIIIsolateproducts,mixAmplifydigest,subclonesequencePvuII現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR產(chǎn)物中引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRAB現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR產(chǎn)物的檢測(cè)現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide,ASO）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）變性梯度凝膠電泳（DGGE）融點(diǎn)曲線分析（meltingcurveanalysis）序列分析現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR-RFLP利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四RFLP診斷鐮狀細(xì)胞貧血現(xiàn)在是74頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四SouthernblotanalysisSouthern印跡雜交現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四Southernblotanalysis現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四ResultsofSouthernBlotControlTissueCancerTissueprobeEE現(xiàn)在是78頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四PCR-SSCP單鏈DNA分子具有特定的二級(jí)空間構(gòu)象，取決于該分子本身的堿基組成突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時(shí)，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA

不同順序不同構(gòu)象不同電泳行為現(xiàn)在是79頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是80頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是81頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四DGGE是一種篩查單堿基突變及多態(tài)性的方法被檢DNA雙鏈分子的解鏈溫度因存在突變而發(fā)生改變，從而使電泳遷移率發(fā)生改變DGGE的突變檢出率可達(dá)90%～100%變性梯度凝膠電泳(DGGE)現(xiàn)在是82頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四(-)(+)DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)現(xiàn)在是83頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)(-)(+)LowHighDenaturant現(xiàn)在是84頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是85頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是86頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四熔點(diǎn)曲線分析

(meltingcurveanalysis)野生型序列和突變序列因不同Tm而產(chǎn)生不同的融點(diǎn)曲線熒光染料標(biāo)記的雙鏈DNA分子或熒光標(biāo)記的探針被儀器的檢測(cè)系統(tǒng)所識(shí)別DNA分子在復(fù)性時(shí)結(jié)合熒光最強(qiáng)，隨溫度的上升熒光量逐漸降低溫度升至其融點(diǎn)溫度（Tm）時(shí)熒光量急劇下降而形成融點(diǎn)曲線，其波峰所在溫度即代表被檢DNA分子的Tm值現(xiàn)在是87頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四Tm值取決于DNA分子的長(zhǎng)度和其序列中G/C堿基含量當(dāng)被檢片段中存在突變時(shí)，就會(huì)有不同于野生型的Tm值而呈現(xiàn)不同的波峰如果一個(gè)被檢片段中存在一個(gè)以上的突變時(shí)，可以出現(xiàn)一個(gè)以上的波峰，從而可以將突變序列檢測(cè)出來(lái)現(xiàn)在是88頁(yè)\一共有96頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是89頁(yè)\