實驗二植物核酸的提取教案

授課教師 學(xué)生人數(shù)55課 題試驗二植物基因組DNA的提取授課類型授課 授課方法講授、演示教學(xué)用具多媒體教學(xué)目的把握CTAB法提取植物基因組DNA的原理與方法教學(xué)重點(diǎn)理解每一步試驗操作的目的教學(xué)難點(diǎn)試驗操作過程中的一些留意事項教學(xué)過程一、背景學(xué)問DNA在細(xì)胞中存在的位置？植物細(xì)胞DNA存在的位置和動物細(xì)胞有何不同？〔圖〕DNA的存在形式雙螺旋構(gòu)造圖雙螺旋構(gòu)造組成染色體是怎樣形成的？一級構(gòu)造〔=雙螺旋+組蛋白二級構(gòu)造〔螺線管三級構(gòu)造〔超螺線管四級構(gòu)造〔染色體〕DNA是經(jīng)過四級包裝形成了染色體，先是DNA小體〔一級構(gòu)造，壓縮7倍，再形成螺旋管〔二級構(gòu)造，壓縮6倍，之后再形成超螺旋管〔三級構(gòu)造，壓縮40倍，最終超螺旋管壓縮形成染色體〔四級構(gòu)造5倍，正常細(xì)胞中基因組DNA〔相當(dāng)于一級構(gòu)造〕形式存在，在細(xì)胞分裂的中期以染色體形式存在，真核生物細(xì)胞質(zhì)DNA的環(huán)狀DNA遺傳物質(zhì)核酸除了DNA外還有另外一種，即RNA，它與DNA在構(gòu)造上的區(qū)分？〔圖〕 根本單位中間的五碳糖是核糖，含氮堿基尿嘧啶〔U〕替代胸腺嘧啶〔T〕核酸的理化性質(zhì)外形：DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、異丙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。二、試驗?zāi)康陌盐誄TAB法提取植物基因組DNA的原理CTAB法提取植物基因組DNA的試驗方法三、試驗原理核酸在細(xì)胞中的存在方式，是以核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在，如一級構(gòu)造核小體〔圖：DNA螺旋+組蛋白通過低溫研缽破壞植物細(xì)胞壁參加CTAB溶解細(xì)胞膜，CTAB與核酸形成核酸-CTAB復(fù)合物，使核酸與蛋白質(zhì)分別。參加高鹽溶液溶解核酸-CTAB復(fù)合物，參加蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)變性沉淀出來，離心除去蛋白質(zhì)。參加核酸沉淀劑，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出來，離心得到核酸沉淀。四、試驗儀器1.水浴鍋2.離心機(jī)12管：3臺10個移液槍〔包括槍頭：1ml、400ul五、試驗材料與藥品試驗材料：穎菠菜葉片1.十六烷基三甲基溴化銨〔CTAB〕商品信息：瓶裝/100g。10份水，溶于熱水、乙醇、三氯甲烷,易溶于異丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。危害：高毒，對皮膚及粘膜刺激性小，有稍微脫脂作用。2.1MTris-HClPH8.0緩沖液作用：供給一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學(xué)物質(zhì)。儲存：室溫保存。危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。〔EDTA-2Na〕作用：螯合Mg2+Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶〔DNase〕活性，活性依靠于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。商品信息：瓶/250g。液pH5.3?？捎蒃DTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。量的消防器材。儲區(qū)應(yīng)備有適宜的材料收容泄漏物。危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用。對眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。Tris飽和酚商品信息：瓶/250ml。Tris-HCl0.25%8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。儲存：4℃避光保存。說明發(fā)生氧化，不能使用。β-巰基乙醇〔2-巰基乙醇〕作用：供給一種復(fù)原劑，這樣酚類物質(zhì)〔植物材料特別是老的材料中含有大量的酚類物質(zhì)〕就不能被DNADNA的試驗CTAB震蕩時產(chǎn)生的泡沫的作用。商品信息：瓶/100g?；烊堋Ｋ腥芙舛龋?mg/mL。儲存：對空氣敏感，易吸潮。 保持密閉，儲存在陰涼、枯燥通風(fēng)處。翻開了的容器必需認(rèn)真重封口并保持豎放位置以防止泄漏。建議貯存溫度2-8℃。危害：高毒吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸取后會中毒。 對環(huán)境有危害，對水體可造成污染。 本品可燃?！睳aCl〕作用：CTAB-核酸復(fù)合物在高鹽溶液中易溶。商品信息：瓶/500g，分析純AR。穩(wěn)定性比較好。儲存：儲存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。應(yīng)與氧化劑分開存放，切忌混儲。危害：無水乙醇作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。商品信息：瓶/500ml，分析純AR?；ト?。30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲。承受防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。制止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%〔體積。氯仿〔三氯甲烷〕〔酚易溶于氯仿。商品信息：瓶/500ml。儲存：保存在密封的棕色瓶中。危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣漸漸被氧化生成劇毒的光氣。異戊醇異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA商品信息：瓶/500ml。理化性質(zhì)：無色液體，有不開心的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機(jī)溶劑。酸類等分開存放，切忌混儲。承受防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。制止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。儲區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和適宜的收容材料。危害：吸入、口服或經(jīng)皮膚吸取有麻醉作用。其蒸氣或霧對眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，熱能引起燃燒爆炸。異丙醇作用：DNA沉淀劑，DNA在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全，而后由于異丙醇不易揮發(fā)，所以用乙醇洗去異丙醇，乙醇揮發(fā)快。用-20約和2.5倍體積的乙醇效果相當(dāng)；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會使局部DNA溶解損失；所以多項選擇用-206500800010分鐘就可以將異丙醇沉淀的核酸嚴(yán)密的離到管底。商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。水混溶，不溶于鹽溶液。酸類、鹵素等分開存放，切忌混儲。承受防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。制止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。儲區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和適宜的收容材料。神經(jīng)。常溫下可引火燃燒，其蒸汽與空氣混合易形成爆炸混合物。PVP-40〔聚乙烯吡咯烷酮〕作用：PVP是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，削減DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。商品信息：白色塑料瓶/100g。儲存：室溫枯燥保存。危害：DNADNAaseDNA。商品信息：分析純理化性質(zhì)：-196℃。液態(tài)的氮?dú)狻Ｊ嵌栊缘?，無色，無臭，無腐蝕性，不行燃，溫度極低。儲存：儲存于陰涼、通風(fēng)的庫房。庫溫不宜超過30℃。危害：汽化時大量吸熱接觸造成凍傷。六、試驗試劑1.氯仿-異戊醇〔24:1〕100ml-20ml=80ml{氯仿96ml+異戊醇4ml}100ml，4℃保存2.酚-氯仿-異戊醇〔25:24:1〕40ml{氯仿-異戊醇〔24:1〕20ml+Tris飽和酚20ml}=40ml，4℃保存3.TE緩沖液PH8.0 50ml{10mMTris-HCl〔PH8.0〕緩沖液0.5ml+0.5MEDTA〔PH8.0〕0.1ml}→·定容到50ml4℃保存【0.5MEDTA〔PH8.0100ml{蒸餾水80mlEDTA-2Na.2H2O18.61g}→用NaOH〔約2g〕調(diào)至PH8.0→定容至100ml→·分裝后高壓滅菌備用。注：需參加NaOHPH8.0才能完全溶解。【10mMTris-HCl〔PH8.0〕緩沖液】的配制：10ml{1MTris-HClPH8.0緩沖液100μl9.9ml}→定容至10ml→10mMTris-HCl〔PH8.0〕緩沖液2%CTAB抽提液250ml{CTAB4g+無水乙醇5ml+水100ml}200ml燒杯中→加熱溶解→再依次參加→·{5MNaCl56ml1MTris-HCl〔PH8.0〕20ml0.5MEDTA8ml}→定容至250ml→高壓滅菌冷卻后參加→{1%β-巰基乙醇〔400ul〕2ml+PVP-405g}→4℃保存【5MNaCl溶液】配制：100ml{NaCl29.22g90ml}→加熱到80℃溶解冷卻后→定容至100ml→高壓滅菌備用1%〔v/v〕β-巰基乙醇】配制：10ml{β-巰基乙醇100μl9.9ml}→1%β-巰基乙醇10ml蒸餾水全部藥劑用水都要純潔水經(jīng)高壓滅菌冷卻七、試驗步驟〔一〕試驗前預(yù)備研缽、異丙醇-20℃1075ml】將2%CTAB465CTAB30ml】稱取301g30g】6510ml90個、藥匙、移液槍1ml100400l、離心機(jī)〔10000r/min〕30m〔每管1ml60m〔每管2ml、無水乙醇12m〔每管400lTE緩沖液3ml〔每管100l〕〔二〕裂開細(xì)胞，釋放溶解核酸將葉片置于預(yù)冷的研缽〔試驗前-20℃預(yù)冷〕中，倒入液氮，盡快研磨成粉末；DNADNase的作用，保護(hù)DNA。將粉末參加10ml離心管中，參加1ml預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動搖勻；植物中酚類物質(zhì)的影響。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶〔DNase〕活性，活性依靠于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。Tris-HCl供給一個緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞。高鹽溶液可以更好的溶解核酸-CTAB將離心管置于654010分鐘輕輕搖擺幾次。目的：水浴使CTAB抽提液和葉片充分反響。〔三〕抽提去掉蛋白質(zhì)21ml-氯仿2分鐘r/min離心10分鐘；3層，上-中-下層：CTAB-核酸-變性蛋白-有機(jī)溶劑〔含CTAB-核酸至的10ml2ml-12000r/min離心10分鐘。目的：其次次離心進(jìn)一步去掉變性蛋白，去掉多余的酚〔四〕沉淀核酸1.留神取上清液〔含CTAB-核酸〕10ml離心管中〔盡量避開吸取中間層〕,參加2.5ml的異丙醇-20℃預(yù)冷30秒15至能見到絮狀物；目的：異丙醇為DNA沉淀劑，異丙醇與CTAB-20℃預(yù)冷的異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好，異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當(dāng)，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會淀更完全。異丙醇易溶于CTAB，但不與核酸相溶。2.10000r/min離心10分鐘,留神倒去上清液。目的：第三次離心使核酸沉淀到管底?！参濉澈怂岬南礈鞜o水乙醇洗滌核酸沉淀直至無色，10000r/min離心10分鐘，傾去上清液晾干。目的：異丙醇不易揮發(fā)，所以用乙醇洗去異丙醇及多余的NaCl，乙醇揮發(fā)快。〔六〕保存向下層離心物中參加100μlTE緩沖液進(jìn)展溶解，置于-20℃冰箱保存，以便下次課用。目的：一般長期保存DNA，貯存在TE緩沖液中比較好。TE為含EDTA的Tris-HCl(PH8.0)緩沖液：其中比較關(guān)鍵的成分是EDTA，日常環(huán)境中不行避開的存在DNase，而DNase的活性依靠于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNaseI可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價錳離子存在條件下，DNaseI可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTADNaseTris-HCl的作用主要是維持肯定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA會影響下游酶切，連接反響以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的效率，假設(shè)接下來要做這些試驗是應(yīng)當(dāng)避開使用含EDTA的緩沖液的。短期儲存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA連接等效果。八、試驗留意事項在整個試