物理圖繪制優(yōu)秀公開(kāi)課

第三章物理圖繪制學(xué)習(xí)要點(diǎn)：物理作圖的方法各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)用遺傳學(xué)技術(shù)作圖對(duì)于指導(dǎo)基因組計(jì)劃的測(cè)序階段還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因?yàn)檫z傳圖譜的局限性：遺傳圖的分辨率有限：依賴(lài)于所得到的交換數(shù)目。遺傳圖的精確性較低：重組熱點(diǎn)的存在。遺傳圖的準(zhǔn)確率有限：環(huán)境因素和取樣誤差，分子標(biāo)記的排列有時(shí)會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)。物理圖譜是以物理距離來(lái)表示各遺傳標(biāo)記之間或DNA序列兩點(diǎn)之間在DNA分子上的位置，以實(shí)際的堿基對(duì)長(zhǎng)度來(lái)度量其物理距離。3.1限制性作圖3.1.1限制性作圖---小分子DNA在連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)相同酶切位點(diǎn)區(qū)段，其排列序列可有多種選擇，此時(shí)采用部分酶切的辦法使該區(qū)段只發(fā)生一次酶切，這稱(chēng)為部分限制作圖。部分限制作圖為構(gòu)建完整的圖譜提供了必須的信息。但如果有多個(gè)限制位點(diǎn)，這種方法就顯得力不從心。特別是內(nèi)部含有大小相同的片段時(shí)，重疊的片段無(wú)法區(qū)分，使排序變得非常復(fù)雜。一個(gè)較簡(jiǎn)單的變通策略使我們可以忽略大量的片段。這種方法是將標(biāo)記物加到要分析的DNA分子兩端，進(jìn)行部分酶切處理后，很多產(chǎn)物成為不可見(jiàn)的，我們利用可見(jiàn)的部分大小，確定那些未定位的切點(diǎn)與DNA分子末端的相對(duì)位置。1)制備---瓊脂糖包埋法2)酶切---稀有酶切位點(diǎn)限制酶3)分離---脈沖電泳分離3.1.2限制性作圖的局限如果基因組較大，切點(diǎn)較多，單、雙、部分酶切的片段會(huì)很多。限制性作圖只能應(yīng)用于較小的DNA分子。大分子DNA的研究策略與方法：2.稀有切點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切酶的應(yīng)用1)稀有切點(diǎn)限制酶：在基因組DNA序列中只有很少可識(shí)別序列的限制酶，一般識(shí)別位點(diǎn)在6-8堿基對(duì)之間,并含有高G/C比。2)選用稀有切點(diǎn)限制酶注意事項(xiàng)：a)識(shí)別位點(diǎn)的非特異序列，-GANTC-(HinfI)，-GCCN4NGCC-(BglI)b)高等生物基因組一般A/T比較高，應(yīng)選G/C高比例限制酶，如-GCGGCCGC-(NotI)c)基因組甲基化狀態(tài)，人類(lèi)基因組DNA中5’-CG-3’的序列較少。稀有切點(diǎn)限制酶常規(guī)與非常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳正交變電場(chǎng)凝膠電泳3.脈沖凝膠電泳3.2基于克隆的基因組作圖

---大分子DNA的克隆基于克隆的基因組作圖：根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊序列構(gòu)建重疊群(Contig)，繪制物理連鎖圖。3.2.1克隆作圖的載體和方法常規(guī)的質(zhì)粒載體不適用于大分子DNA的克隆。大分子DNA克隆載體構(gòu)建:YAC,BAC,HAC,MAC酵

母

人

工

染

色

體（YAC）端粒：用于保護(hù)線狀的DNA不被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒：有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。自主復(fù)制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)。YAC的主要缺點(diǎn)：

1．存在高比例的嵌合體，即一個(gè)YAC克隆含有兩個(gè)本來(lái)不相連的獨(dú)立片段；

2．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會(huì)發(fā)生缺失或重排；

3．難與酵母染色體區(qū)分開(kāi)，因?yàn)閅AC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu);

4．轉(zhuǎn)化效率低。

細(xì)菌人工染色體（BAC）：以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)，人工構(gòu)建的環(huán)狀的DNA分子。可以攜帶大于100-350Kb的外源DNA片段。選擇標(biāo)記：氯霉素抗性基因等。BAC載體的優(yōu)點(diǎn)：較為穩(wěn)定；沒(méi)有嵌合現(xiàn)象；轉(zhuǎn)化效率高；BAC克隆易于操作和DNA提?。籅AC文庫(kù)篩選方便?；蚪M文庫(kù)：指將基因組DNA通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)的同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了某種有機(jī)體整個(gè)基因組。1)目標(biāo)基因組大分子DNA的制備；2)載體制備；3)載體和DNA的連接；4)轉(zhuǎn)化；5)轉(zhuǎn)化子鑒定。YAC和BAC基因組文庫(kù)的構(gòu)建插入大分子DNA的分離載體制備與插入DNA連接1)YAC載體：制備過(guò)程與一般質(zhì)粒載體相同。2)BAC載體：低拷貝載體，大量制備，超離心純化。3)酶切：釋放接頭，接頭去磷，減少自連。4)連接：將含有大分子DNA的瓊脂糖薄片與載體混合,按重量比1:1，680C保溫5min，降溫至370C，加入連接酶過(guò)夜。

3.2.3指紋作圖—3種指紋在基因組范圍內(nèi)查找重疊的克隆，最好的方法是克隆指紋排序。指紋指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段組成。限

制

性

片

段

指

紋

作

圖

原

理限制性片段指紋電泳圖指紋重疊群構(gòu)建酵母基因組遺傳圖與物理圖的整合3.3染色體細(xì)胞圖細(xì)胞圖：通過(guò)原位雜交的方法將基因或DNA分子標(biāo)記定位在染色體的某一區(qū)段，由此繪制圖稱(chēng)為細(xì)胞圖。最常用的細(xì)胞圖繪制技術(shù)為熒光原位雜交。（fluorescentinsituhybridization,FISH）原位雜交是以標(biāo)記的DNA分子為探針，檢測(cè)完整染色體的一種雜交分析方法，其必須使染色體DNA成為單鏈。熒光原位雜交一種封閉雜交探針中重復(fù)序列的方法限制性作圖不能用于大型基因組；克隆重疊群復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；FISH難于操作，數(shù)據(jù)積累慢。目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對(duì)大型基因組產(chǎn)生最詳盡圖譜的技術(shù)，是STS作圖，主要為輻射雜種作圖。3.4序列標(biāo)簽位點(diǎn)

（Sequencetaggedsite,STS）作圖STS是一段短的DNA序列，其長(zhǎng)度通常為100—500bp。一段DNA序列要成為STS需滿(mǎn)足兩個(gè)條件：1.它的序列必須是已知的，便于PCR檢測(cè)；2.STS必須在擬研究的染色體上有唯一的定位。尋找STS的方法1）從EST序列中尋找2）SSLP3）隨機(jī)基因組序列1.STS在染色體上的位置是確定的。2.兩個(gè)不同的STS出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)取決于它們?cè)诨蚪M中的位置，彼此接近，同時(shí)出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)就大，反之則小。

輻射雜種作圖原理STS作圖與連鎖分析是一樣的，不同之處僅在于兩個(gè)標(biāo)記間的圖距是根據(jù)分離頻率來(lái)計(jì)算的。主要采用的方法是輻射雜種作圖。輻射雜種（放射雜交體）：指含有另一種生物染色體片段的嚙齒類(lèi)細(xì)胞。輻射雜種作圖的程序與方法輻射雜種群PCR檢測(cè)STS標(biāo)記，根據(jù)成對(duì)STS出現(xiàn)頻率，判斷標(biāo)記是否連鎖及連鎖程度輻射雜種圖距單位

輻射雜種的作圖單位為厘鐳(centiRay,cR)：DNA分子暴露在N拉徳(rad)X射線劑量下兩個(gè)分子標(biāo)記之間發(fā)生1%斷裂的機(jī)率。利用類(lèi)似于遺傳重組原理和最大似然性的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)計(jì)算存在于DNA片段上的STS之間的斷點(diǎn)頻率，以此估計(jì)標(biāo)記之間的距離?！禨tatisticalMethodsforMultipointRadiationHybridMapping》人類(lèi)21號(hào)染色體輻射雜種圖人類(lèi)21號(hào)染色體輻射雜種物理圖人類(lèi)基因組物理圖譜:人類(lèi)基因組序列開(kāi)始測(cè)定時(shí)，已有45萬(wàn)個(gè)EST，其中有一些重復(fù)序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析篩選后得到49625個(gè)。再?gòu)闹泻Y選出3萬(wàn)個(gè)EST、2個(gè)輻射雜交系庫(kù)（分別有83和93個(gè)細(xì)胞株）、1個(gè)有32000個(gè)克隆的YAC文庫(kù)，用于構(gòu)建物理圖譜。構(gòu)建物理圖譜的密度為每個(gè)標(biāo)記183Kb。EST分布結(jié)果表明，基因在染色體上的排列是不均勻的。將物理圖譜和遺傳圖譜整合而成更加完整的人類(lèi)基因組圖譜，作為基因組測(cè)序的框架和分析的依據(jù)。討論：遺傳圖譜和物理圖譜哪一個(gè)更加有用？圖譜的應(yīng)用---定位克?。▓D位克隆）定位克?。╬ositionalcloning）：利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶并對(duì)目的基因進(jìn)行克隆。定位：通過(guò)連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。定位克隆的主要目的之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上。

A-1型短指（趾）癥：法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文中首先報(bào)道了這一病癥，即世界上第一例孟德?tīng)柍Ｈ旧w顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)的經(jīng)典例子被全世界的生物學(xué)和遺傳學(xué)教材廣泛引用。賀林等利用布依族、苗族和漢族的三個(gè)A-1型短指（趾）癥大家系，對(duì)該病的致病基因進(jìn)行了精確定位（位點(diǎn)定在2q35-36區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因上的三個(gè)突變位點(diǎn)是導(dǎo)致A-1型短指（趾）癥的直接原因。番茄抗病基因的圖位克隆定位候選克隆該方法是定位克隆的進(jìn)一步發(fā)展。將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域；該染色體區(qū)域得到若干候選基因；進(jìn)一步分析得到目的cDNA；蛋白質(zhì)功能研究。疾病染色體定位若干候選基因確定目的基因蛋白質(zhì)功能功能克隆克?。ㄖ虏。┗虻牧硪环N策略。收集所要克隆的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其功能的信息，用以分離基因，并對(duì)基因進(jìn)行定位。性狀（疾?。┑鞍踪|(zhì)產(chǎn)物（生物學(xué)功能）從氨基酸序列出發(fā)設(shè)計(jì)DNA引物，從文庫(kù)調(diào)取基因得到基因序列染色體定位疾病功能基因分析異?；虻漠a(chǎn)物（蛋白質(zhì)），弄清它是如何引起臨床癥狀的：純化蛋白質(zhì)，進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，據(jù)此推測(cè)可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中篩選對(duì)應(yīng)的編碼基因；絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷病如白化病（albinism）、苯丙酮尿癥（PKU）和鐮刀形細(xì)胞貧血病（sickle-celldisease）等，都是采取的這一策略。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)儀熒光染料對(duì)染色體染色。熒光探測(cè)器確定含有正確染色體的液滴發(fā)出的信號(hào)，并將一個(gè)電荷加到液滴上Science：發(fā)現(xiàn)新抑癌基因SDH5郝淮湘博士從一個(gè)功能未知的蛋白入手，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)疾病基因并闡明了其分子功能和致病機(jī)理。

SDH5,aGeneRequiredforFlavinationofSuccinateDehydrogenase,IsMutatedinParagangliomaHuai-XiangHao1,OlehKhalimonchuk2,MargitSchraders3,NoahDephoure4,Jean-PierreBayley5,HenricusKunst6,PeterDevilee7,CorW.R.J.Cremers6,JoshuaD.Schiffman8,BrandonG.Bentz9,StevenP.Gygi4,DennisR.Winge2,HannieKremer3,JaredRutter1*郝淮湘，一位在美國(guó)諾華生物醫(yī)學(xué)研究所接受博后訓(xùn)練的80后大男孩，在《Science》上發(fā)表了一篇漂亮的研究性文章，文章被同期的Nature雜志推薦為亮點(diǎn)研究成果。郝淮湘1999－2003年在廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專(zhuān)業(yè)就讀，最后一年在長(zhǎng)江學(xué)者林圣彩教授實(shí)驗(yàn)室完成了本科畢業(yè)論文。2003年8月來(lái)到美國(guó)猶他州鹽湖城的猶他大學(xué)就讀，次年加入醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的JaredRutter教授實(shí)驗(yàn)室，在其指導(dǎo)下進(jìn)行博士論文研究，2009年5月答辯。2009年6月至今，在波士頓劍橋的諾華生物醫(yī)學(xué)研究所（NovartisInstitutesforBioMedicalResearch）進(jìn)行博士后訓(xùn)練。生物通：作為一名80后的年輕人，您可以說(shuō)十分年輕，就已經(jīng)獲得生命科學(xué)領(lǐng)域的博士學(xué)位，能談?wù)勀鰢?guó)求學(xué)的成長(zhǎng)歷程嗎？可以給我們的青年讀者介紹一下在美國(guó)學(xué)習(xí)的感受嗎？郝淮湘：其實(shí)我拿到博士學(xué)位并不算早，花了將近六年（2003－2009），有人四年多就博士畢業(yè)了。來(lái)美國(guó)后第一年主要是上課和在四個(gè)實(shí)驗(yàn)室輪轉(zhuǎn)（可以從將近100個(gè)實(shí)驗(yàn)室選擇）。這邊上課沒(méi)有教科書(shū)，一門(mén)課多個(gè)教授授課，很多時(shí)候都是直接講文獻(xiàn)，一個(gè)部分上完就考一次試，記憶的東西不多，主要是分析能力。第二年的時(shí)候，我根據(jù)自己的興趣和對(duì)導(dǎo)師和課題的判斷加入了一個(gè)新成立的實(shí)驗(yàn)室，跟年輕導(dǎo)師做研究雖然會(huì)辛苦一點(diǎn)，但是的確能學(xué)很多東西，也有機(jī)會(huì)了解如何建立實(shí)驗(yàn)室和從頭構(gòu)思課題。在此后的5年里，我接觸了多個(gè)研究項(xiàng)目，一些失敗了，最后有兩個(gè)得以發(fā)表，并順利畢業(yè)?？傮w而言，我覺(jué)得美國(guó)的博士教育制度還是比較有效的。

生物通：在Science上發(fā)表文章很不容易，除了英語(yǔ)要過(guò)關(guān)外，您還有什么忠告給讀者嗎？郝淮湘：英語(yǔ)的確很重要，但