細胞工程第九章轉基因動物與生物反應器詳解演示文稿

細胞工程第九章轉基因動物與生物反應器詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有66頁\編輯于星期三1（優(yōu)選）細胞工程第九章轉基因動物與生物反應器現(xiàn)在是2頁\一共有66頁\編輯于星期三2轉GH基因超級小鼠現(xiàn)在是3頁\一共有66頁\編輯于星期三3轉基因兔、牛、豬、羊、魚、小鼠……

現(xiàn)在是4頁\一共有66頁\編輯于星期三4新加坡國立大學生物系轉基因斑馬魚1.熒光魚現(xiàn)在是5頁\一共有66頁\編輯于星期三5現(xiàn)在是6頁\一共有66頁\編輯于星期三6現(xiàn)在是7頁\一共有66頁\編輯于星期三72.蜘蛛羊現(xiàn)在是8頁\一共有66頁\編輯于星期三8研究者將高度活躍的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因轉化的老鼠在運動時有效利用身體脂肪產生能量，同時避免產生大量乳酸。3.超級老鼠現(xiàn)在是9頁\一共有66頁\編輯于星期三9不怕貓的老鼠。在科學家展示的照片中，一只褐色老鼠離一只貓不到一英寸，在貓的身邊嗅來嗅去。研究人員確認并移除了老鼠大腦嗅球上的某些感受器，結果這些老鼠變成了一群無所畏懼的嚙齒動物，在天敵面前轉來轉去，顯示出極強的好奇心，永遠不知道危險的存在。

4.無所畏懼老鼠現(xiàn)在是10頁\一共有66頁\編輯于星期三10

2003年7月11日由陳系古教授領導的“人類轉基因動物模型的制作”課題組歷時5年，研制成功了四種轉基因小鼠。其中，熒光鼠為胚胎干細胞、人類基因功能、人體組織工程和克隆器官等研究提供了基礎；患白化病的小鼠轉導了酪氨酸酶基因后長出了黑毛；四環(huán)素調控系統(tǒng)和丙肝核心抗原的轉基因小鼠分別傳到第四、第三代，為制備人類丙肝病毒感染的雙基因動物模型提供了父代、母代?，F(xiàn)在是11頁\一共有66頁\編輯于星期三11現(xiàn)在是12頁\一共有66頁\編輯于星期三12現(xiàn)在是13頁\一共有66頁\編輯于星期三13現(xiàn)在是14頁\一共有66頁\編輯于星期三14轉基因動物模型優(yōu)勢：可以從整體水平、器官水平、組織水平、分子水平進行多層次、全方位、深入而又系統(tǒng)的綜合研究?，F(xiàn)在是15頁\一共有66頁\編輯于星期三15借助基因工程技術將外源基因導入受體動物染色體內，外源基因與動物基因整合后隨細胞的分裂而擴增，在體內表達并能穩(wěn)定的移轉給后代的動物稱為轉基因動物。一、轉基因動物（transgeneticanimal）現(xiàn)在是16頁\一共有66頁\編輯于星期三16目的基因的來源采用限制性內切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；目的基因的克隆?，F(xiàn)在是17頁\一共有66頁\編輯于星期三17顯微注射法病毒介導的生物學方法胚胎干細胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它二、培育轉基因動物的方法現(xiàn)在是18頁\一共有66頁\編輯于星期三181.顯微注射轉基因技術利用顯微操作技術轉移外源基因的方法。此法轉入基因長度可達數(shù)百kb；并能隨機地整合在受體體細胞染色體DNA上，因此應用范圍廣?，F(xiàn)在是19頁\一共有66頁\編輯于星期三19microinjection現(xiàn)在是20頁\一共有66頁\編輯于星期三20現(xiàn)在是21頁\一共有66頁\編輯于星期三21受精卵顯微注射制備轉基因動物的缺點1.外源基因整合至基因組的效率很低，對經濟大動物（猴、牛、羊）的整合效率更低；2.隨機整合，轉基因整合的位點和拷貝數(shù)無法控制，造成轉基因的表達差異很大，篩選高表達轉基因動物的工作量很大；3.對經濟大動物，由于需要大量的供體和受體，耗時長、費用昂貴，受到很大的限制。現(xiàn)在是22頁\一共有66頁\編輯于星期三22將目的基因重組到逆轉錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后的胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共同培養(yǎng)以達到感染目的),獲得轉基因動物的方法。

2、逆轉錄病毒感染法現(xiàn)在是23頁\一共有66頁\編輯于星期三23

優(yōu)點：受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單，避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高現(xiàn)在是24頁\一共有66頁\編輯于星期三24缺點：容納大小有限(<10-15kb)重組逆轉錄病毒的長末端容易甲基化，影響外源基因的表達潛在致癌性,載體復雜整合率不高,胚胎自我保護機制對其有抗性現(xiàn)在是25頁\一共有66頁\編輯于星期三253.胚胎干細胞方法現(xiàn)在是26頁\一共有66頁\編輯于星期三26

優(yōu)點：外源基因整合情況的可控性高?？深A先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因導入ES細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便。現(xiàn)在是27頁\一共有66頁\編輯于星期三27

缺點：ES細胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體現(xiàn)在是28頁\一共有66頁\編輯于星期三28目前，胚胎干細胞介導法在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚?，F(xiàn)在是29頁\一共有66頁\編輯于星期三294.精子載體導入法現(xiàn)在是30頁\一共有66頁\編輯于星期三30

5酵母人工染色體載體法（YAC）利用酵母人工染色體(ＹＡＣ)作為載體制作轉基因動物的方法。

酵母人工染色體（ＹＡＣ）載體是近年來發(fā)展起來的新型載體,能克隆百萬對堿基的大片段ＤＮＡ。

現(xiàn)在是31頁\一共有66頁\編輯于星期三31

優(yōu)點：保證大片段ＤＮＡ的完整性。

保證較長外源片段在轉基因動物研究中的整合率提高。

保證了目的基因上下游的側翼序列的完整性,因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應。

現(xiàn)在是32頁\一共有66頁\編輯于星期三326、體細胞核移植法

將外源基因導入到體細胞中，再將該細胞進行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細胞進行擴增，用這種細胞的細胞核進行核移植（把體細胞核植入一個去了核的卵母細胞中，融合并激活），將重組胚進行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動物的輸卵管?，F(xiàn)在是33頁\一共有66頁\編輯于星期三337.其它方法……性腺轉基因方法

現(xiàn)在是34頁\一共有66頁\編輯于星期三34

總結：轉基因動物的制作方法1、受精卵雄原核顯微注射法2、胚胎干細胞（ES細胞）法3、逆轉錄病毒感染法4、精子載體法5、YAC法6、體細胞核移植法現(xiàn)在是35頁\一共有66頁\編輯于星期三35顯微注射法病毒介導的生物學方法胚胎干細胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它基因打靶二、培育轉基因動物的方法現(xiàn)在是36頁\一共有66頁\編輯于星期三36基因打靶利用細胞脫氧核糖核酸(DNA)可與外源性DNA同源序列發(fā)生同源重組的性質，定向改造生物某一基因的技術。1、基因敲除（geneknockout）2、基因替換（geneknockin）現(xiàn)在是37頁\一共有66頁\編輯于星期三37基因敲除（geneknockout），指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中,而獲得的內源目的基因缺失或功能喪失的轉基因動物?，F(xiàn)在是38頁\一共有66頁\編輯于星期三38基因替換（geneknockin），指外源DNA與受體基因組中特定的內源基因發(fā)生同源重組而相關的兩個內源基因中的一個基因的編碼區(qū)被另一個基因的編碼區(qū)的拷貝所置換的基因動物?，F(xiàn)在是39頁\一共有66頁\編輯于星期三39基因打靶基因敲除（geneknockout）將基因組特定內源基因定點突變基因替換（geneknockin）將基因組特定內源基因進行定向重組現(xiàn)在是40頁\一共有66頁\編輯于星期三40顯微注射法病毒介導的生物學方法胚胎干細胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它基因打靶二、培育轉基因動物的方法現(xiàn)在是41頁\一共有66頁\編輯于星期三41三、轉基因動物的檢測現(xiàn)在是42頁\一共有66頁\編輯于星期三42DNA的提取PCR/RT-PCRSouthern雜交表達產物的檢測（蛋白/下游產物）現(xiàn)在是43頁\一共有66頁\編輯于星期三43

Southern印跡雜交技術是分子生物學領域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量?，F(xiàn)在是44頁\一共有66頁\編輯于星期三441、改良動物品種2、生物制藥3、動物模型4、異體器官移植5、基因治療四、轉基因動物的應用現(xiàn)在是45頁\一共有66頁\編輯于星期三45轉基因動物的低效性轉入基因造成宿主基因突變問題轉入基因的表達問題病毒轉基因研究存在的問題轉基因動物模型與預期不符問題乳腺生物反應器的問題社會問題五、轉基因動物研究存在的問題現(xiàn)在是46頁\一共有66頁\編輯于星期三46六、細胞轉染常用方法現(xiàn)在是47頁\一共有66頁\編輯于星期三471.電穿孔法實現(xiàn)外源基因的轉移利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，從而使外源DNA轉移至細胞中。此法簡單、效率較高，廣泛應用于培養(yǎng)細胞的基因轉移?，F(xiàn)在是48頁\一共有66頁\編輯于星期三482.磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉移技術這種方法是受二價金屬離子能促進細胞菌吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時，細胞攝取DNA的能力顯著加強。磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞。不適用于原代細胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡便但重復性差,有些細胞不適用現(xiàn)在是49頁\一共有66頁\編輯于星期三493.脂質載體法將需要轉移的外源DNA或RNA包裹于脂質體內，由于脂質體具有磷脂雙層結構，與細胞膜類似，因此可以與受體細胞膜融合，從而將外源DNA轉入宿主細胞。這種方法轉基因效率高?，F(xiàn)在是50頁\一共有66頁\編輯于星期三50現(xiàn)在是51頁\一共有66頁\編輯于星期三514.病毒介導的生物學方法（1）逆轉錄病毒（RNA病毒）（2）腺病毒（雙鏈DNA病毒）現(xiàn)在是52頁\一共有66頁\編輯于星期三52現(xiàn)在是53頁\一共有66頁\編輯于星期三53現(xiàn)在是54頁\一共有66頁\編輯于星期三54現(xiàn)在是55頁\一共有66頁\編輯于星期三55比利時藍?，F(xiàn)在是56頁\一共有66頁\編輯于星期三56動物生物反應器現(xiàn)在是57頁\一共有66頁\編輯于星期三57

一般把目的片段在器官或組織中表達的轉基因動物叫動物生物反應器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經過人為馴化為生物反應器,從生產的角度考慮，生物反應器選擇的組織和器官要方便產物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應器,動物血液生物反應器和動物膀胱生物反應器等。其中，轉基因動物乳腺生物反應器的研究最為引人注目?，F(xiàn)在是58頁\一共有66頁\編輯于星期三58一、動物血液生物反應器

外源基因在血液中表達的轉基因動物叫血液生物反應器。大家畜的血液容量較大,利用動物血液生產某些蛋白質或多肽等藥物己取得了一定進展。外源基因編碼產物可直接從血清中分離出來,血細胞組分可通過裂解細胞獲得?，F(xiàn)在是59頁\一共有66頁\編輯于星期三59二、動物膀胱生物反應器

外源基因在膀胱中表達的轉基因動物生物反應器,叫動物膀胱生物反應器。膀胱尿乳頭頂端表面可表達一組尿血小板溶素的膜蛋白,這種蛋白在膀胱中表達具有專一性,而且它的基因是高度保守的,將外源基因插入5′端調控序列中,就可以指導外源基因在尿中表達?，F(xiàn)在是60頁\一共有66頁\編輯于星期三60三、動物乳腺生物反應器

動物乳腺生物反應器利用哺乳動物乳腺特異性表達的啟動子元件構建轉基因動物,指導外源基因在乳腺中表達,并從轉基因動物的乳液中獲取重組蛋白。現(xiàn)在是61頁\一共有66頁\編輯于星期三611.動物乳腺生物反應器的制備（1）表達載體的構建目前用于表達載體的啟動子調控元件選用動物乳蛋白基因啟動子元件，主要有四類乳腺定位表達調控元件：第一類是B2乳球蛋白(BLG)，第二類是酪蛋白基因調控序列：第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調控序列；第四類是乳清白蛋白基因調控序列。現(xiàn)在是62頁\一共有66頁\編輯于星期三62（2）目的基因的選擇選擇目的基因的基本要求是，正常情況下濃度低、翻譯后修飾復雜、其它表達