高效液相色譜法測定大鼠血漿中白藜蘆醇含量及其藥物代謝動力學

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課程平日考核

作業(yè)題目高效液相色譜法測定大鼠血漿中白藜蘆醇含量及其藥

物代謝動力學_____________________________

成績

課程名稱生物藥劑學與藥物動力學學院華西藥學院考核序號1專業(yè)藥學年級班級2023級2班學生姓名陳宇學號0845051028完成日期2023年5月18日

高效液相色譜法測定大鼠血漿中白藜蘆醇含量

及其藥物代謝動力學

DeterminationofResveratrolinRatPlasmabyHigh

PerformanceLiquidChromatographyandItsPharmacokinetics1試驗目的

白藜蘆醇(resveratrol，RES)化學名稱為反-3，5，4’-三羥基-1，2-二苯乙烯(亦稱芪三酚)，是重要的自然活性化合物[1]，是大量植物在受到真菌感染、紫外照射或病理狀況下產(chǎn)生的-種多酚類植物抗毒素，目前已知7O多種自然植物中含有RES，主要存在于葡萄、葡萄汁、紅酒及其他植物提取物中?，F(xiàn)已證明RES具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗血小板聚集、調(diào)理免疫、保護肝臟及雌激素樣作用[2]。目前，有文獻報道采用現(xiàn)代儀器分析方法，如氣相色譜-質(zhì)譜、毛細管電泳和高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)測定酒或食物中的RES含量。大量體內(nèi)與體外試驗說明，RES具有廣泛的生物學活性，但有關RES在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學研究報道甚少。本試驗建立高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)測定大鼠血漿中白藜蘆醇濃度，并用該法研究大鼠靜脈注射白藜蘆醇后的藥物代謝動力學，為該藥的體內(nèi)過程及應用提供理論和試驗依據(jù)。

2材料

2.1試驗動物

Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，質(zhì)量(180±20)g，合格證號為皖醫(yī)實動準字01號，由安徽醫(yī)科大學試驗動物中心提供，試驗前禁食12h，但可以自由飲水。1.2試驗儀器

島津高效液相色譜儀：包括LC-10AT泵、CBM-10Alite控制器、SPD-10Avp紫外檢測器、CTO-10ASvp柱溫箱、LC-Solution工作站；XW-80A微型旋渦混合器：上海醫(yī)大儀器廠；TGL-l6GB臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠；BP211D型電子天平：德國Sartorius公司；JL-l8O超聲儀。1.3藥品與試劑

RES：成都蘭貝植化科技有限公司，含量≥98%，批號081228；乙腈：色譜純，天津市恒星化學試劑制造有限公司；甲醇：色譜純，XX漢邦科技有限公司；

1

水為雙蒸水；其余試劑均為分析純。

3方法

3.1色譜條件

色譜柱：ShimadzuVP-ODS(5μm，150mmX46mm)；滾動相：乙腈-水(35：65)；流速：1.0ml/min；紫外檢測波長：303nm；柱溫25℃；進樣量：20μl；靈敏度：0.001AUFS。3.2RES標準液

配制縝密稱取RES5.0mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，使母液濃度為0.50mg/ml。并配制標準品相應系列的濃度、配制相應標準曲線及質(zhì)控濃度。整個試驗配制RES濃度過程是在室溫避光條件下操作，該條件下分析樣品中RES穩(wěn)定性良好。3.3血漿樣品采集

取SD雄性大鼠，試驗前12h開始禁食不禁水，尾部靜脈注射RES20mg/kg，于給藥后5，10，30，60，90，l20，180，240，360，420min取血，置于肝素化試管中，12000r/min離心5min，分開血漿，即刻血漿樣品經(jīng)過相應處理后，采用HPLC對其進行分析。3.4血漿樣品處理

取血漿200μm置于1.5mlEppendorf(EP)管中，參與400μl乙腈沉淀蛋白，于渦旋混合器上混勻3min后，12000r/min離心5min。取上清液20μl進樣，峰面積外標法定量分析。

4考察參數(shù)及意義

4.1方法的專屬性

在本色譜條件下，對空白血漿、對照品血漿及大鼠靜脈注射RES5min后血漿樣品進行HPLC分析。對HPLC色譜圖進行分析，如樣品色譜峰形良好，理論塔板數(shù)大于1000，血漿中雜質(zhì)與RES分開良好（分開度>1.5），且雜質(zhì)不干擾樣品的測定，則該方法具有較高的專屬性。4.2線性范圍及最低檢測限

在每20μl空白血漿中，分別參與RES系列標準品溶液，配制血漿中RES濃度分別為0.023，0.092，0.184，0.368，0.738，1.480，2.950，5.900，11.800和23.600μg/ml。按上述血漿樣品處理步驟操作，并進行色譜分析。以RES標準對照品的峰面積(A)對相應的濃度(C，μg/m1)進行線性回歸，得血漿標準曲線方程,標準差r，線性范圍及本法測定血漿中RES的最低定量限。

2

4.3提取回收率和縝密度

用大鼠空白血漿配制濃度為0.092，0.738，11.800pg/ml低、中、高3種不同濃度的RES標準血漿樣品，按上述“3.4〞項下方法處理，記錄血漿樣品中RES色譜峰面積記為Ax；同時，取200μl空白血漿于1.5mlEP管中，分別向其中參與400μl乙腈，渦旋3min，于12000r/min離心5min，移取上清液再分別向其中參與相應標準品儲存液配制成相應的低、中、高3種濃度，于渦旋混合器上混勻3min后，于12000r/min離心5min，取20μl進樣、分析、記錄峰面積為As，比較上述兩者峰面積，計算RES的提取回收率。同時測定日內(nèi)和日間相對標準差。4.4血漿樣品室溫避光放置穩(wěn)定性考察

在室溫(25℃)避光放置10h，分別于0，2，4，6，8，10h按“3.4〞項下方法處理，代入當天的隨行標準曲線，計算出低、中、高3種濃度的RSD。如實測濃度與參與濃度比值基本穩(wěn)定，說明質(zhì)控樣品在室溫避光條件下放置10h內(nèi)穩(wěn)定。

4.5RES在雄性大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學

取禁食但可以自由飲水的雄性大鼠，靜脈注射RES(X0=20mg/kg)后，測得平均血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，以此計算靜脈注射RES(20mg/k)后藥動學參數(shù)。4.5.1根據(jù)二室模型計算

查閱相關資料，發(fā)現(xiàn)靜脈注射白藜蘆醇苷脂質(zhì)體溶液，其分布消除符合二室模型[3]，即符合C=A?e-αt+B?e-βt通式，其中，α和β為混雜參數(shù)。

1、根據(jù)血藥濃度-時間曲線消除相數(shù)據(jù)求β和B:以末端的血藥濃度的對數(shù)對時間作圖，即作lnC-t圖，構成的直線，截矩為lnB，斜率為-β。

2、根據(jù)殘數(shù)濃度Cr求α和A。以實測濃度C減去外推濃度C’得到外推濃度Cr，以lnCr-t作圖即為殘數(shù)線，其截矩為lnA，斜率-α。

3、消除半衰期（t1/2（β），血漿藥物濃度或體內(nèi)藥物總量減少1/2，Half-Life）

所需時間，反映藥物消除過程。消除快的藥物t1/2短，消除慢的藥物t1/2長。經(jīng)5個t1/2后藥物濃度下降到原來的3%左右，可認為基本消除完畢。根據(jù)該藥的半衰期長短決定給藥的間隔時間。對于肝、腎功能不好的患者來說，半衰期相對延長，如按常規(guī)給藥，有引起中毒的危險。

t1/2（?）?0.693?

4、藥物從中央室消除的一級速率常數(shù)k10

??k10?A?B

5、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）

AUC0→420min指藥物從零時間至420min這一段時間的藥-時曲線下總面積AUC0→n=(1/2)(C1+C2)(t2-t1)+(1/2)(C2+C3)(t3-t2)+??+(1/2)(Cn-1+Cn)(tn-tn-1)

3

AUC0→∞指藥物從零時間至所有原形藥物全部消除這一段時間的藥-時曲線下總面積，反映藥物進入血循環(huán)的總量。

AUC0???

Cn1C?Ct?t????????a?1aaa?1?k2?106、總清除率（CL,Totalbodyclearance）單位時間內(nèi)有多少毫升血中的藥物

被清除，是正確估算藥物從體內(nèi)消除速度的唯一參數(shù)

CL=(X0)iv其中X0為靜脈注射藥量。

(AUC)iv4.5.2根據(jù)矩量估算藥物動力學參數(shù)

1、平均滯留時間(MRT)平均滯留時間是導入機體的所有藥物分子在體內(nèi)停留的平均時間

一次給藥將向機體輸入眾多藥物分子。這些分子在體內(nèi)停留不同時間，有的很快消除，有的則停留很長時間。其總體結果便是所有分子滯留時間的分布，故可用平均值加以表征。

MRT???0?tcdtcdt??0AUMCAUC

2、生物半衰期t1/2=0.693MRT3、清除率CL

(X0)iv(AUC)iv

4、穩(wěn)態(tài)時的表觀分布容積Vss，它是反映藥物穩(wěn)態(tài)特征的參數(shù)之一，與藥物消除無關

CL=Vss?

X0XMRTAUMC??0AUCAUCAUC

5探討

1.試驗的優(yōu)缺點

優(yōu)點：本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定大鼠血漿中白藜蘆醇含量及

其藥物代謝動力學，與氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MC）、毛細管電泳（CE）以及紫外分光光度法(UC)相比，有著高壓、速度快、分析精度高、所需樣本量少等優(yōu)點。

4

缺點：

1)樣品處理過程困難，需篩選適合的萃取方法。在大鼠血漿處理中，采用

乙醚液——液萃取法提取效率不高，而采用甲醇直接沉淀蛋白，離心后得到的上清液放置后有大量蛋白沉淀，不能完全地除去蛋白，雖然該法操作簡便、經(jīng)濟、快速，但回收率低，且沉淀效果不如乙腈。故試驗采用乙腈直接沉淀蛋白，血漿中參與2倍量的乙腈，可充分沉淀蛋白并且提取RES效率較高，操作簡單、便利、效率高，符合生物藥代動力學研究。

2)滾動相的篩選繁雜。有文獻報道用甲醇：水(48：52)為滾動相[4]，經(jīng)過

試驗發(fā)現(xiàn)，此滾動相不能與雜質(zhì)峰分開。經(jīng)過滾動相配比及選擇后確定采用乙腈：水(35：65)，可獲得較短的保存時間，同時又可以與雜質(zhì)峰分開。

3)檢測波長的篩選繁雜。文獻報道了280，306nm等多種檢測波長[5]，本

試驗通過波長掃描顯示顯示RES在303nm處有最大吸收峰，且干擾最小。2．試驗能解決的問題

大鼠靜脈注射RES后，可分別用二室模型和矩量求算t1/2、MRT、AUC、AUC0→∞、Vss和CL等藥物動力學參數(shù)。這些藥動學參數(shù)，有助于對RES客觀藥物評價，新藥的能動設計、改進藥物劑型、提供高效、速效、長效、低毒副作用的藥劑，為了更好地評價RES的藥用價值，對其在體內(nèi)的代謝特點有待進一步的研究。

缺點：

1)樣品處理過程困難，需篩選適合的萃取方法。在大鼠血漿處理中，采用

乙醚液——液萃取法提取效率不高，而采用甲醇直接沉淀蛋白，離心后得到的上清液放置后有大量蛋白沉淀，不能完全地除去蛋白，雖然該法操作簡便、經(jīng)濟、快速，但回收率低，且沉淀效果不如乙腈。故試驗采用乙腈直接沉淀蛋白，血漿中參與2倍量的乙腈，可充分沉淀蛋白并且提取RES效率較高，操作簡單、便利、效率高，符合生物藥代動力學研究。

2)滾動相的篩選繁雜。有文獻報道用甲醇：水(48：52)為滾動相[4]，經(jīng)過

試驗發(fā)現(xiàn)，此滾動相不能與雜質(zhì)峰分開。經(jīng)過滾動相配比及選擇后確定采用乙腈：水(35：65)，可獲得較短的保存