基因工程的基本操作程序公開課課件

1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取1目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2原理：DNA復(fù)制目的：大量獲得目的基因多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列PCR擴(kuò)增儀模板DNA95℃PCR擴(kuò)增過(guò)程PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物272℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR技術(shù)的操作過(guò)程a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板受熱變性，_____斷裂，形成________b、復(fù)性（退火）（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，_____與DNA模板結(jié)合，形成局部DNA雙鏈。c、延伸（70℃-75℃）：在_____的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNADNA鏈引物Taq酶重復(fù)循環(huán)a-c過(guò)程，每一次循環(huán)后目的基因可以增加____倍，也就是成________形式擴(kuò)增。一指數(shù)3.利用DNA合成儀人工合成前提：基因比較小、核苷酸序列已知DNA合成儀表達(dá)載體的組成啟動(dòng)子：終止子：標(biāo)記基因：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（基因表達(dá)載體）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化:目的基因進(jìn)入_____

____內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_

___和___

__的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞③過(guò)程：Ti質(zhì)粒目的基因表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色體DNA表達(dá)新性狀1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（2）基因槍法

①操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。

②

常用金屬顆粒有鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。

③適用：?jiǎn)巫尤~植物1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（3）花粉管通道法

①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞

②

特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。

③例子：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉顯微注射法（最常用，最有效）（3）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法——受體細(xì)胞——受精卵目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物過(guò)程：2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（2）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞過(guò)程：Ca2+處理受體細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子思考：早期的基因工程用什么作受體細(xì)胞？為什么？常用原核生物，因?yàn)樵松锓敝晨?、多為單?xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等。大腸桿菌最常用。方法——用Ca2+處理細(xì)胞細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針轉(zhuǎn)基因生物的mRNA1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交將抗原-抗體相雜交，若有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品2、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)活性比較實(shí)驗(yàn)

例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。1、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，根據(jù)受體細(xì)胞的不同，選用的方法不同，若導(dǎo)入的是植物細(xì)胞，則常用____________，若導(dǎo)入的對(duì)象是動(dòng)物，則用______作為受體細(xì)胞，然后用________,若導(dǎo)入的是微生物細(xì)胞，則用____________。2、基因工程是否成功，我們還要進(jìn)行最后的檢測(cè)和鑒定。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因應(yīng)采用_____________，檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA應(yīng)采用___________，檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，應(yīng)進(jìn)行____________。