HIV感染和AIDS的實(shí)驗(yàn)診斷課件

HIV感染和AIDS的實(shí)驗(yàn)診斷

HIV感染及AIDS的實(shí)驗(yàn)診斷揭開AIDS歷史的第一頁(yè)MMWR

JUNE5,1981/VOL.30/NO.21MORBIDITYANDMORTALITYWEEKLYREPORT1.發(fā)展簡(jiǎn)史

1983年,法國(guó)巴斯德研究所分離到一種新的逆轉(zhuǎn)錄病毒，命名為L(zhǎng)AV。1984年美國(guó)國(guó)立癌腫研究所分離出命名為HTLV-Ⅲ的病毒。同年，美國(guó)加州大學(xué)分離出AIDS相關(guān)病毒（AIDSRelatedVirus,ARV）.1986年，非洲西部發(fā)現(xiàn)了另一種病毒．國(guó)際微生物學(xué)會(huì)及病毒分類學(xué)會(huì)統(tǒng)一命名為HIV。一）生物學(xué)特征2.HIV的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能HIV呈球形或卵形，直徑為100-120nm，雙層結(jié)構(gòu)。核心由兩個(gè)相同拷貝的RNA及蛋白質(zhì)、反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶及整合酶組成，核心外為病毒衣殼，20面體立體對(duì)稱，有蛋白質(zhì)（P17/P18、P24/P25）。最外層是膜蛋白。包膜上有刺突，含糖蛋白gp120，在雙層脂質(zhì)中有g(shù)p41

。一）生物學(xué)特征HIV病毒顆粒及其結(jié)構(gòu)蛋白和其他毒粒蛋白HIV基因編碼的產(chǎn)物及其功能HIV結(jié)構(gòu)蛋白包括:核心蛋白(gag),包膜蛋白(env)聚合蛋白(pol)。核心蛋白包括:P17位于核蛋白與殼層之間的基質(zhì)上，包被于包膜蛋白的內(nèi)部。P24和P15包被于內(nèi)部核酸外圍核衣殼主要為P24。包膜蛋白為糖蛋白:gp160是前體分子，在感染初期產(chǎn)生，然后分解成gp120和gp41。聚合酶蛋白包括:P66、P51和P31，聚合酶抗原位于病毒的核區(qū)內(nèi)，與病毒核酸緊密相關(guān)。其功能為轉(zhuǎn)錄RNA為DNA；整合病毒DNA到宿主細(xì)胞的DNA上和切割前體分子使之成為有活性的小分子。HIV的結(jié)構(gòu)蛋白HIV-1分為M、O、N三組，M組包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10個(gè)亞型，加上O、N型共12個(gè)亞型。HIV-2至少有A、B、C、D、E、F等6個(gè)亞型。3.HIV的病原特異性：HIV-1亞型全球分布B,a,c,d,f,oA,O,d,g,hB,a,d,e,oBBBBB,f,cB,eBCA,D,eC,a,dC,a,b,eC,E,bE,bB,e,cB,eB,a,c,d,g,hB,iUNAIDSDec.1996非洲及亞洲部分地區(qū)有重組株病毒。HIV的亞型特點(diǎn)有相對(duì)優(yōu)勢(shì)亞型同一亞型差異很大亞型內(nèi)的變異水平估算存在時(shí)間不同亞型傳播途徑和致病性不一不同亞型對(duì)抗-HIV藥物引起耐藥不同亞型重組屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，復(fù)制速度快可感染人體各種細(xì)胞，造成多器官損傷破壞具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能T4淋巴細(xì)胞在血液、淋巴液、精液、陰道分泌液和乳汁中其抗體無保護(hù)作用對(duì)外界抵抗力弱（低于乙肝病毒）人類免疫缺陷病毒全球愛滋病感染人數(shù)及感染途徑

根據(jù)聯(lián)合國(guó)愛滋病委員會(huì)和世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年新感染愛滋病帶毒者410萬。(24h全球增加16000感染者)

因HIV死亡的人數(shù)超過了280萬,已超過了肺結(jié)核(病死率200萬)和瘧疾(100萬).1.西方國(guó)家HAART的使用，患病率和病死率在下降，而發(fā)展中國(guó)家AIDS形勢(shì)嚴(yán)峻；2.以注射吸毒和性傳播(以異性間的傳播為主)；3.不潔的血液采集;4.女性病例上升；母嬰傳播5.兒童病例增加（<15歲）。近年AIDS流行特點(diǎn)：AIDS的流行情況蘇州市自92年起共發(fā)現(xiàn)艾滋病例600多例,而去年一年的新感染者達(dá)190余例,這些統(tǒng)計(jì)數(shù)字充分表明了我國(guó)目前真可謂艾滋病病毒感染的迅速增長(zhǎng)期。(體檢發(fā)現(xiàn))

聯(lián)合國(guó)艾滋病中國(guó)專題組在北京以《中國(guó)艾滋?。何ｋU(xiǎn)的泰坦尼克號(hào)》為題發(fā)布了2001年中國(guó)艾滋病形勢(shì)的最新報(bào)告。報(bào)告警告說，中國(guó)正處在艾滋病災(zāi)難的邊緣，一艘巨輪正在沖向冰山。1.HIV借助CD4受體結(jié)合到靶細(xì)胞表面，通過靶細(xì)胞的內(nèi)吞作用和gp41的融合作用，其細(xì)胞膜被穿透，病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；2.在RT作用下，第一條RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，繼之以第一條DNA為模板，形成前病毒；3.在整合酶作用下，形成的雙股DNA整合到宿主細(xì)胞中，感染持續(xù)存在；4.前病毒成為潛伏狀態(tài)；5.前病毒DNA復(fù)制，具有新一代病毒的遺傳物質(zhì)；6.復(fù)制好的新病毒顆粒，再感染別的細(xì)胞，而原感染的細(xì)胞死亡三）致病機(jī)制2.HIV的感染過程1.“窗口期”:感染HIV到相應(yīng)抗體產(chǎn)生.2.“急性感染期”

:一般在一月后產(chǎn)生抗體，平均45天。在急性感染期病毒復(fù)制明顯，血中?？沙霈F(xiàn)P24抗原和HIVRNA，也可培養(yǎng)到HIV。3.“潛伏期”:可持續(xù)數(shù)月至17年以上。此時(shí)僅能檢出抗體，但有低濃度HIV復(fù)制。4.AIDS臨床階段。急性HIV感染誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答的進(jìn)程HIV的感染過程HIV的感染過程4.HIV感染后的T細(xì)胞變化CD4+T持續(xù)不斷下降，及Th1,Th2亞群失調(diào)．對(duì)抗原反應(yīng)性減低．細(xì)胞因子如IFN-r,TNF-a水平升高，產(chǎn)生細(xì)胞因子的功能受損，如IL1,IL2能力下降；CD8+T早期有較明顯上升，發(fā)病前1-2年明顯下降，CTL功能下降，但如加IL-2處理可恢復(fù)活性。CD3+T在早期下降不明顯，在AIDS發(fā)病前1-2年出現(xiàn)明顯下降。CD4+淋巴細(xì)胞的格局HIV的病毒培養(yǎng)與分離；HIV的毒株分析；HIV核酸測(cè)定；（AbbottLCxHIV-RNA）P24抗原的測(cè)定；第四代酶免試劑HIV抗體測(cè)定：常分為初篩和確認(rèn)兩步。初篩實(shí)驗(yàn)室和常用初篩方法有：

HIV病毒抗體金標(biāo)快速法（InstantCHEK-HIV1+2）愛滋病毒抗體篩選酶免試劑（MUREXHIV）DetermineHIV1+2+0亞型試紙（Abbott）雙抗原夾心酶免試劑

確認(rèn)試驗(yàn)主要是免疫印跡技術(shù)（WesternBlot,WB）四）HIV的實(shí)驗(yàn)診斷1.HIV抗體檢測(cè)試劑盒1985.3HIV-11990.6HIV-21992.4HIV-1/2敏感度和特異度不斷提高．三代ELISA均達(dá)99%以上.1998.三代ELISA檢測(cè)ＨIV1/HIV2(P24Ab).2008.四代ELISA(ＨIV1/HIV2(P24Ag))

快速診斷試劑(膠體金標(biāo)記)EIA實(shí)際試劑盒進(jìn)展代次抗原方法檢測(cè)時(shí)間1全病毒間接>2個(gè)月2重組或多肽間接42-45d3重組+多肽夾心

22d4抗原+抗體夾心

16d(抗原5pg)5基因擴(kuò)增法，基因芯片

6-11.5dHIV抗體篩查試劑1.MurexHIV1.2.O：

第三代抗體試劑的雙抗原夾心法模式兩步法酶標(biāo)法測(cè)試，可以用來檢測(cè)HIV抗體I型，II型和O亞型。手工/自動(dòng)化酶標(biāo)儀檢測(cè)，用血清/血漿樣本。MurexHIV-1.2.O.夾心模式板底樣本結(jié)合物抗原包被（1）辣根過氧化物酶標(biāo)記抗原（2）模式：雙抗原夾心法。MurexHIV-1.2.O抗原HIV-1envHIV-1envHIV-1envHIV-1envHIV-1envHIV-2envHIV-1envHIV-1p24

HIV-1envPODPOD

PODHIV-O

HIV-OHIV-2多肽抗原重組抗原板結(jié)合物CDSDPODHIV-1envHIV-1p24HIV-1p24P41/p36前帶/后帶效應(yīng)的機(jī)制兩步?jīng)_洗法---可避免此效應(yīng)低濃度的結(jié)合物高濃度的結(jié)合物

HOOK效應(yīng)的機(jī)制Ag變構(gòu)是二步夾心酶免出現(xiàn)鉤狀HOOK的原因．被測(cè)抗原如具有多重決定族與親和性高于包被抗體的酶標(biāo)抗體發(fā)生交叉重疊結(jié)合，由于立體效應(yīng)和互相擠壓，Ag分子發(fā)生構(gòu)象改變而從包被抗體上脫落，造成反應(yīng)信號(hào)下降．2.POCT在艾滋病毒檢測(cè)中的應(yīng)用快速DetermineHIV1/2O抗體檢測(cè)第三代抗體試劑的雙抗原夾心法模式可以用來檢測(cè)HIV抗體I型，II型和O亞型。可用手指/靜脈血，15分鐘出結(jié)果，可用血清/血漿/全血樣本結(jié)果可密封保存?？焖僭噭┭兄频谋尘熬偷貦z測(cè)（POCT）概念：

急診----手術(shù)，緊急輸血，事故緊急檢測(cè)。（醫(yī)護(hù)人員和病人的保護(hù)）篩查概念： 母嬰篩查，就職，移民，性及吸毒犯罪人員體檢等----簡(jiǎn)單易用。日常檢測(cè)： 大，中，小型實(shí)驗(yàn)室，及極少量HIV樣本實(shí)驗(yàn)室，偏遠(yuǎn)地區(qū)，實(shí)驗(yàn)室條件或設(shè)備不齊，外出檢測(cè)----方便攜帶，使用。結(jié)果可保存。

靈敏度排名及分?jǐn)?shù)產(chǎn)品排名分?jǐn)?shù)GenscreenHIV1/21237MurexHIV1.2.O2235ImxHIV?III3231OrthoHIV1/23231AbbottHIV?Beads4229Murex1/25227OrganonUniII..x5..214-225InnotestHI1/2Last1783.第四代試劑及抗原有關(guān)的試劑HIV抗原/抗體聯(lián)合試劑：MurexHIVAg/Ab：第四代試劑

大大提高靈敏度的篩查試劑，進(jìn)一步縮短了檢測(cè)“窗口期”。RIADeltaHIVAg/Ab：放免HIV抗原/抗體聯(lián)合試劑。

HIV抗原試劑：MurexHIV抗原單克隆試劑： 臨床上只用于HIV抗原檢測(cè)以早期檢測(cè)樣本，或觀察HIV疾病進(jìn)程。MurexHIV抗原確認(rèn)試劑,確認(rèn)抗原試劑陽(yáng)性樣本。HIV–標(biāo)記物CDCgroupICDCgroupII/IIICDCgroupIVHIVAg/RNAIgMIgG(env)IgG(p24)HIVAg/RNA第一代第二代第三代第四代抗原補(bǔ)充4.HIV特殊試劑HIV抗體WB確認(rèn)試劑： 為唯一一種經(jīng)典和全球公認(rèn)的抗體確認(rèn)試劑，2..2版本包含有極早期血清轉(zhuǎn)換片段，便于早期樣本的確認(rèn)。LCxHIV核酸物質(zhì)定性/定量分析：（LCR和PCR技術(shù)） 用于HIV病人遺傳物質(zhì)檢測(cè)，可用于部分確認(rèn)，和病人治療監(jiān)測(cè)。結(jié)構(gòu)蛋白HIV-1HIV-2envgp160前體gp140gp120外部gp105/125gp41跨膜gp36/41polP66逆轉(zhuǎn)錄酶p68P51逆轉(zhuǎn)錄酶p53P31內(nèi)切酶p31/34gagp55前體p56p24核心p26p17基質(zhì)p16

WesternBlot分析HIV蛋白

Westernblot原理HIV病毒核酸分析和血清學(xué)免疫測(cè)定比較血清學(xué)免疫測(cè)定核酸分析感染后天數(shù)天血清HIV抗體核酸分析5.自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)原理雙功能試劑：抗RBC,gp120簡(jiǎn)單，快速，微量，不需分離血清有假陽(yáng)性6.HIV亞型分析；

HIV變異的識(shí)別；7.細(xì)胞因子的測(cè)定；8.PCR追蹤HIV自然感染史。HIV的實(shí)驗(yàn)診斷

世界愛滋病日1988年１月將每年的１２月１日定為世界愛滋病日，號(hào)召世界各國(guó)和國(guó)際組織在這一天舉辦相關(guān)活動(dòng)，宣傳和普及預(yù)防愛滋病的知識(shí)．在