離心技術(shù)與細(xì)胞器分離

離心技術(shù)與細(xì)胞器分離現(xiàn)在是1頁\一共有21頁\編輯于星期四一

實驗?zāi)康?、以分離葉綠體、細(xì)胞核為例,掌握離心機的操作技術(shù)及兩種不同的離心方法：差速離心法、密度梯度離心法;

2、光鏡鑒定各種細(xì)胞器的提取情況及了解葉綠體、細(xì)胞核的形態(tài)。現(xiàn)在是2頁\一共有21頁\編輯于星期四二實驗原理離心技術(shù)（centrifugaltechnique）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運動時都會受到一個向外的力這一原理而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）現(xiàn)在是3頁\一共有21頁\編輯于星期四離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運動時受到的一個向外的力。離心力（Fc）的大小取決于角速度與旋轉(zhuǎn)半徑，即：

Fc=mω2r其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；r是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以g為單位?，F(xiàn)在是4頁\一共有21頁\編輯于星期四相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）

又稱相對離心加速度，是指離心力相當(dāng)于重力加速度的倍數(shù)。在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示。RCF=(mω2r)/(mg)=1.119×10-5n2r式中r為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，指離心管的重心至轉(zhuǎn)軸中心間的距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。現(xiàn)在是5頁\一共有21頁\編輯于星期四離心力的轉(zhuǎn)換列線圖

現(xiàn)在是6頁\一共有21頁\編輯于星期四離心機制備性分析性分析性超速離心機普通離心機冰凍離心機臺式（或地面式）普通離心機大容量冰凍離心機小于0.6萬轉(zhuǎn)/分高速冰凍離心機0.6-2.5萬超速冰凍離心機2.5-8萬或更高

概述臺式高、超速離心機0.6-10萬轉(zhuǎn)/分以上

離心機的基本分類現(xiàn)在是7頁\一共有21頁\編輯于星期四離心機的結(jié)構(gòu)

離心機的主要部件為轉(zhuǎn)頭、主軸、電動機和傳動裝置、制動器、外殼和機座?，F(xiàn)在是8頁\一共有21頁\編輯于星期四離心機的轉(zhuǎn)頭主要有：角度轉(zhuǎn)頭（angle-headedrotors）、甩平式水平轉(zhuǎn)頭（swing-outrotors）/吊桶式轉(zhuǎn)頭（swingingbucketrotors）

水平轉(zhuǎn)頭

角度轉(zhuǎn)頭現(xiàn)在是9頁\一共有21頁\編輯于星期四離心技術(shù)類型

常用離心技術(shù)一般包括：差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）密度梯度離心法(densitygradientcentrifugation)?，F(xiàn)在是10頁\一共有21頁\編輯于星期四差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降系數(shù)不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時間下分批分離的方法，稱為差速離心法。常用于從組織勻漿中分離各種細(xì)胞器?，F(xiàn)在是11頁\一共有21頁\編輯于星期四Figure8-9MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)Thepreparativeultracentrifuge現(xiàn)在是12頁\一共有21頁\編輯于星期四差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）現(xiàn)在是13頁\一共有21頁\編輯于星期四密度梯度離心原理：當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，在密度梯度介質(zhì)中，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置，在這里顆粒沒有重量，不管離心多長時間，它們再也不移動了，形成一系列密度區(qū)。從而使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。等密度梯度離心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時。常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)?！，F(xiàn)在是14頁\一共有21頁\編輯于星期四Densitygradientcentrifugation

現(xiàn)在是15頁\一共有21頁\編輯于星期四Densitygradientcentrifugation

現(xiàn)在是16頁\一共有21頁\編輯于星期四現(xiàn)在是17頁\一共有21頁\編輯于星期四實驗步驟1．將材料用蒸餾水洗凈。用濾紙吸干水后,去葉脈,稱取2克葉片,用剪刀剪碎后放入研缽。2．量取10ml勻漿buffer，先向研缽中倒入5ml后開始研磨。3．四層紗布過濾，收集過濾液到10ml離心管中，再將剩下的5ml勻漿buffer沖洗研缽后也過濾到管中，5000rpm離心5分鐘,去上清。4．加入0.5%TritonX-1002.5ml,混勻，振蕩后靜置3分鐘.5000rpm離心5分鐘，去上清。5．加入1mlCSKbuffer振蕩混勻,可以用槍頭輕輕吹打沉淀使其溶解.現(xiàn)在是18頁\一共有21頁\編輯于星期四6．濾膜過濾（300目）,去掉未裂解的原生質(zhì)體及裂解的細(xì)胞膜內(nèi)溶物等大塊雜質(zhì)，收集過濾液。

以上步驟所提到的細(xì)胞核不純,其中混雜有原生質(zhì)體、線粒體、葉綠體,下面采用蔗糖密度梯度離心分離細(xì)胞核和葉綠體。7.把含有2.3M蔗糖的CSKbuffer3ml加至于離心管底部.8.再把3ml60%percollCSKbuffer輕輕的平鋪于7的溶液上方,用移液槍加時一定要小心順著管壁把一溶液平鋪于另一溶液之上.這時應(yīng)該能觀察到溶液明顯的分層現(xiàn)象.9.然后把6中過濾溶液輕輕的平鋪于8的溶液上方。觀察分層現(xiàn)象。10.3200g離心32分鐘，溶液梯度層重新分布。11.分別吸取一些各層的溶液進行改良品紅苯酚染色、鏡檢。觀察不同大小不同密度的細(xì)胞器的分布情況以及他們的形態(tài)特征。

現(xiàn)在是19頁\一共有21頁\編輯于星期四試劑

勻漿buffer：5mMMES,6.8mMCaCl2,11mMKH2PO4,0.3M山梨醇,0.3M甘露醇,0.4％PVP-30．

CSKbuffer:100mMKCl,3mMMgCl2,1mMEGTA(PH8.0),10mMPIPES(PH6.8),300mMsucrose.

60%percollCSKbuffer

：60%percoll,100mMKCl,3mMMgCl2,1mMEGTA(PH8.0),10mMPIPES(PH6.8),300mMsu