酶與酶工程緒論99優(yōu)秀公開(kāi)課

分子酶與酶工程緒論課程介紹教材：《酶與酶工程》袁勤生、趙健主編，華東理工大學(xué)出版社主要參考教材：《分子酶學(xué)工程導(dǎo)論》張今、曹淑桂、羅貴民等主編，科學(xué)出版社《現(xiàn)代酶工程》梅樂(lè)和、岑沛霖主編，化學(xué)工業(yè)出版社《生物催化—基礎(chǔ)與應(yīng)用》，AndreasS.Bommarius,BettinaR.riebel,孫志浩、許建和譯，化學(xué)工業(yè)出版社微生物是地球上重要的可再生資源，有著重要的應(yīng)用價(jià)值。1.1關(guān)于酶Enzyme酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功能的生物分子/蛋白質(zhì)。研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的性質(zhì)及作用機(jī)理對(duì)于闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)具有十分重要的意義。從酶的水平去探討生命活動(dòng)的關(guān)系，探討酶與代謝調(diào)節(jié)、疾病、生長(zhǎng)發(fā)育等的關(guān)系，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐意義。酶是一類(lèi)特殊的催化劑酶是高效催化劑。典型的表觀二級(jí)速率常數(shù)(kcat/Km)為106~108L/(mols)能在溫和條件下有效地催化很難、甚至不可能的化學(xué)轉(zhuǎn)化(kcat/kuncat)可達(dá)1017。酶是有高度選擇性的催化劑。酶對(duì)映體的選擇性日益強(qiáng)勁地用于手性藥物生產(chǎn)。酶促反應(yīng)副產(chǎn)物少、條件溫和。酶的催化反應(yīng)由于極大地簡(jiǎn)化了化學(xué)反應(yīng)的條件，因而使化學(xué)試劑的應(yīng)用和副產(chǎn)物大量減少，從而在很大程度上減少了對(duì)環(huán)境的污染。由于日益增加的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)壓力，生物催化劑得到了迅速發(fā)展。微生物為酶提供了豐富的、可再生的資源基因工程技術(shù)進(jìn)一步解決了稀有酶的來(lái)源問(wèn)題目前已鑒定的酶有3000多種。TemperatureclassesIndustrialapplicationofthermophilyIndustrialenzymesHigherspeedLowercostTaqDNApolymeraseandPCRDNAamplificationRepetitivemeltingandannealing（退火）95oC-52oC-72oCHumaninsulinproducedbyengineeredbacteria.Antibioticresistantmarker1.2關(guān)于酶工程EnzymeEngineering酶工程是生物工程的主要內(nèi)容之一。是隨著酶學(xué)研究的迅速發(fā)展特別是酶的應(yīng)用推廣使酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透，結(jié)合而發(fā)展成的一門(mén)新的科學(xué)技術(shù)，是酶學(xué)、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的交叉學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶在一定生物反應(yīng)裝置中利用酶的催化性質(zhì)，將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)，是生物工程的重要組成部分。酶是生物體內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制新陳代謝所不可缺少的生物催化劑。由于酶能在常溫、常壓、中性pH等溫和條件下高度專(zhuān)一有效地催化底物發(fā)生反應(yīng)，所以酶的開(kāi)發(fā)和利用是當(dāng)代生物技術(shù)革命中的重要課題。生物酶工程則是以酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，主要包括：①用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）；②修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）；③設(shè)計(jì)新的酶基因，合成自然界不曾有的新酶。1.3分子酶學(xué)工程（MolecularEngineering）是酶工程在分子水平上的體現(xiàn)。分子酶學(xué)工程包括在分子水平認(rèn)識(shí)酶的基礎(chǔ)上改進(jìn)、模擬酶和全新設(shè)計(jì)酶。分子酶學(xué)工程的內(nèi)涵是以天然酶的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，以酶分子工程為核心，研究工程酶的理論、策略和方法，研究工程酶的催化效率和機(jī)制，開(kāi)發(fā)酶的新功能、新性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)實(shí)用的新型生物催化劑。分子酶學(xué)工程的概念分子酶學(xué)工程可以看做是蛋白質(zhì)工程（包括分子進(jìn)化）和酶工程相融合所產(chǎn)生的一門(mén)科學(xué)技術(shù)。分子酶學(xué)工程包括在分子水平認(rèn)識(shí)酶的基礎(chǔ)上改進(jìn)酶、模擬酶和全新設(shè)計(jì)酶。改進(jìn)，模擬，設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)分析功能分析純化工程酶分子酶學(xué)工程基本流程圖天然酶分子酶學(xué)工程的概念分子酶學(xué)工程的內(nèi)涵:是以天然酶的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，以酶分子工程為核心，研究工程酶的理論、策略和方法，工程酶的催化效率和機(jī)制，開(kāi)發(fā)酶的新功能、新性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)實(shí)用的新型生物催化劑。分子酶學(xué)工程的出現(xiàn)表明人們已經(jīng)按照自己的意圖來(lái)改進(jìn)、模擬和設(shè)計(jì)新酶并且正在有效地把工程酶應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)建設(shè)和科學(xué)技術(shù)研究中去。在了解催化機(jī)制的基礎(chǔ)上人為地提高酶的催化效率是分子酶學(xué)工程的主要目標(biāo)，并由此創(chuàng)造出高催化效率、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的酶。分子酶學(xué)工程的基本策略和方法分子酶學(xué)工程研究主要涉及三個(gè)相互關(guān)系的內(nèi)容：一是發(fā)展構(gòu)建工程酶的理論、策略和方法；二是在考察和研究生物多樣性的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)新的酶及其工程化；三是擴(kuò)大工程酶的應(yīng)用領(lǐng)域。分子酶學(xué)工程的基本策略和方法1）在對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能分析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因工程、蛋白質(zhì)工程（包括分子進(jìn)化）技術(shù)改變或完善天然酶某些性質(zhì)并構(gòu)建出更加實(shí)用的新酶，如進(jìn)化酶、模塊酶和雜和酶等；

2）在分子免疫學(xué)、有機(jī)化學(xué)和分子酶學(xué)基礎(chǔ)上，應(yīng)用細(xì)胞工程、抗體工程及分子印記等技術(shù)從理論和實(shí)際兩方面研究抗體酶、合成酶、印記酶和酶的化學(xué)修飾；

分子酶學(xué)工程的基本策略和方法3）非水相分子酶學(xué)工程的研究打破了酶只能在水相中催化的傳統(tǒng)概念，不僅開(kāi)辟了分子酶學(xué)工程的新領(lǐng)域，而且為酶在化學(xué)、材料科學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)及生物檢測(cè)中的應(yīng)用展示了廣闊的前景，同時(shí)也可能成為發(fā)展和實(shí)現(xiàn)“綠色化學(xué)”的一個(gè)關(guān)鍵的突破點(diǎn)；

分子酶學(xué)工程的基本策略和方法4）核酶和脫氧核酶也成為分子酶學(xué)工程的一個(gè)新領(lǐng)域，別構(gòu)酶和脫氧酶的設(shè)計(jì)和應(yīng)用將可能成為納米技術(shù)中的重要內(nèi)容；5）生物傳感器是分子酶學(xué)工程不可分割的組成部分，

它正向生物芯片、生物計(jì)算機(jī)方向發(fā)展；

分子酶學(xué)工程的基本策略和方法6）組合生物催化（combinatorialbiocatalysis）可以高效率產(chǎn)生新型化合物庫(kù)，為酶的抑制劑和酶標(biāo)藥物的設(shè)計(jì)開(kāi)辟一條新途徑?；蚪M學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)展將會(huì)推動(dòng)和幫助新酶的發(fā)現(xiàn)。

工程酶的分類(lèi)

蛋白質(zhì)酶非蛋白酶模擬酶核酶(ribozyme,RNAzyme)脫氧核酶(detoxribozyme,DNAzyme)肽酶(pepzyme)抗體酶(abzyme)合成酶(synzyme)印記酶(imprintingenzyme)雜合酶(hybridenzyme)模塊酶(modularenzyme)進(jìn)化酶(evolvedenzyme)蛋白質(zhì)工程酶化學(xué)修飾酶工程酶（水相，非水相）1.4酶與酶工程的研究趨勢(shì)從發(fā)展方向分析，今后十年酶與酶工程領(lǐng)域的研究熱門(mén)有以下幾方面：酶結(jié)構(gòu)與功能的研究生物催化過(guò)程的研究改造酶的催化特性及新酶設(shè)計(jì)應(yīng)用酶工程1、酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究：研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化作用機(jī)理永遠(yuǎn)是酶學(xué)研究的主題。酶的結(jié)構(gòu)尤其是動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、功能尤其是空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系共同構(gòu)筑了分子酶學(xué)的主要內(nèi)容，功能酶學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的滲入和參與為酶學(xué)研究增加了新內(nèi)涵。2、生物催化過(guò)程的研究：通常生物催化過(guò)程不受通用的技術(shù)或底物和產(chǎn)物性質(zhì)的限制。新的催化過(guò)程的可行性往往由生物催化劑效率決定。生物催化過(guò)程不同于常規(guī)的化學(xué)過(guò)程，它經(jīng)常受到在技術(shù)條件下的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及在細(xì)胞中生理生化作用的影響。過(guò)程底物產(chǎn)物經(jīng)濟(jì)情況產(chǎn)物回收生物催化劑選擇生物催化劑表征生物催化劑工程應(yīng)用篩選酶或細(xì)胞動(dòng)力學(xué)反應(yīng)條件結(jié)構(gòu)信息細(xì)胞工程過(guò)程工程酶工程蛋白質(zhì)工程新反應(yīng)穩(wěn)定性固定化輔因子再生多相系統(tǒng)下游原位回收生物催化過(guò)程的開(kāi)發(fā)流程生物催化過(guò)程又是典型的高度不均一過(guò)程，理論上需要特殊設(shè)計(jì)的硬件部分，需要有高催化效率的生物催化劑，需要實(shí)施計(jì)算機(jī)控制的軟件，需要能降低成本的回收和再利用技術(shù)，這是生物催化過(guò)程，尤其是工業(yè)生物催化的四個(gè)“必需”。3、改造酶的催化特性及新酶設(shè)計(jì)改造酶的特性最有效的方法是定位突變（Site-directedMutagenesis）和定向進(jìn)化（DirectedEvolutioninVitro）。定位突變技術(shù)只對(duì)某些氨基酸殘基進(jìn)行替換、刪除、天加或修飾，并不能從根本上改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，故有一定的局限性。體外定向進(jìn)化不需要酶的結(jié)構(gòu)、功能關(guān)系和催化機(jī)制方面的信息。它采用隨機(jī)過(guò)程，用易錯(cuò)PCR（Error-pronePCR）產(chǎn)生基因突變從而進(jìn)行篩選。體外重組或DNA改組（DNAShuffling）促進(jìn)了定向進(jìn)化的發(fā)展。這些方法迅速地組合了有益突變并拓展了順序的多樣性。獲得L-天冬氨酸進(jìn)化酶的活力比天然酶高28倍；天冬氨酰酶二肽酶進(jìn)化酶的活力比天然酶提高47倍；對(duì)海藻糖-6-磷酸合成酶的操縱子的定向進(jìn)化，建立Shuffling-PCR方法，使海藻糖的產(chǎn)量提高12.3倍。定位突變和定向進(jìn)化兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如果將兩者組合，會(huì)出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，定向進(jìn)化方法可以有效地?cái)U(kuò)大定位突變，定位突變可以把關(guān)鍵氨基酸或結(jié)構(gòu)片段引入酶分子中，這是定向進(jìn)化辦不到的。反之，定向進(jìn)化也可以與定位突變結(jié)合起來(lái)，用定位限制隨機(jī)以減少篩選的庫(kù)容；用隨機(jī)擴(kuò)大定位以增加突變位點(diǎn)。此方法是通過(guò)控制合成的底物和濃度比例來(lái)實(shí)現(xiàn)堿基對(duì)的錯(cuò)配。構(gòu)建新酶是酶工程研究的前沿和熱點(diǎn)，如根據(jù)過(guò)渡態(tài)理論采用誘導(dǎo)法、拷貝法、插入法、化學(xué)修飾法和基因工程法制備抗體酶。隨著催化作用機(jī)理及化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，使用分子印跡和生物印跡技術(shù)制備的人工合成酶將會(huì)在諸如氧化還原反應(yīng)、有機(jī)相酶反應(yīng)及特殊催化反應(yīng)中大顯身手。核酶可催化四種反應(yīng)。除RNA有催化活性外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)DNA也有酶活性，此外還發(fā)現(xiàn)RNA具有催化自身復(fù)制的功能。RNA具有信使編碼功能與催化功能，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，是生命進(jìn)化中最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的與催化自身復(fù)制加工的RNA世界的原始方式，這種高度序列特異的核酶很大的應(yīng)用價(jià)值。4、應(yīng)用酶工程研究重點(diǎn)放在：①開(kāi)辟酶或微生物法轉(zhuǎn)化合成有用化合物的新途徑。在有機(jī)合成中重點(diǎn)解決不對(duì)稱(chēng)合成和拆分醇、醛、酮、酸、胺、氨基酸、抗生素等手性化合物及藥物。②非水相介質(zhì)中酶促催化是新熱點(diǎn)。非水相介質(zhì)中酶催化已應(yīng)用于許多有用的藥物，生物大分子、手性化合物、化工中間體及非天然產(chǎn)物等有機(jī)合成，突破了酶水相催化的