微生物的計數(shù)及分離純化

微生物的計數(shù)及分離純化第1頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四微生物的計數(shù)

一、目的要求1、了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、計數(shù)原理和計數(shù)方法，掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能。2、學(xué)習(xí)平板菌落計數(shù)的基本原理和方法

第2頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗原理

測定微生物細胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。

顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤（PetrofHausser）細菌計數(shù)板。第3頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四認識顯微鏡第4頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四鏡筒：單筒：直立式（長度為160mm）、后傾式（傾斜45°）雙筒：傾斜式轉(zhuǎn)換器：3~5個孔載物臺：方形、圓形

中央有一通光孔，孔的兩側(cè)裝有標本夾，還有移動器（其上有刻度標尺）調(diào)節(jié)器（粗、細）：

鏡壁上：升降鏡壁調(diào)焦鏡壁下：升降載物臺調(diào)焦第6頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四顯微鏡的使用方法步驟：1、取鏡和安放2、對光3、觀察4、整理與存放第8頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四右手握住鏡壁，左手托住鏡座把顯微鏡放在實驗臺邊緣5厘米左右處，略偏左，安裝好目鏡取鏡和安放第9頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四對光轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使用低倍物鏡對準光孔（注意不要用手扳物鏡?。。。┑?0頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四觀察把所要觀察的玻片標本放在載物臺上，用夾片夾住，標本要正對通光孔第11頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，順時針旋轉(zhuǎn)，使鏡筒緩緩下降，直到物鏡接近玻片標本為止（物鏡尖端距載玻片約0.5cm）第12頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四左眼向目鏡內(nèi)看，同時逆時針轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，使鏡筒緩緩上升，直到看清物象為止。再略微轉(zhuǎn)動細準焦螺旋，使看到的物象更加清晰第13頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四如果粗準焦螺旋調(diào)節(jié)旋鈕旋得太快，超過焦點，需要將粗準焦螺旋調(diào)到最低，重新尋找焦點觀察時雙眼睜開（不疲勞），若是單筒顯微鏡也用左眼觀察，便于繪圖。第14頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四高倍鏡的操作1、先用低倍鏡找到目的物并移至視野中央；2、轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，換至高倍鏡；3、觀察目的物，同時微微上下轉(zhuǎn)動細準焦螺旋，直到視野內(nèi)看到清晰的目的物為止。第15頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

油鏡的操作

1、先按低倍鏡到高倍鏡的操作步驟找到目的物，并將目的物移到視野中央；2、在載玻片上滴一滴香柏油（或液體石蠟），將油鏡移至正中使鏡面浸沒在油中，剛好貼近載玻片。一般情況下，轉(zhuǎn)過油鏡即可看到目的物，如果不夠清晰，回調(diào)節(jié)細準焦螺旋，即可看清目的物。3、觀察完畢，用擦鏡紙將鏡頭的油揩干凈，另外用擦鏡紙蘸少許二甲苯揩拭鏡頭，再用擦鏡紙揩干。第16頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四整理與安放1、觀察完畢，先提升鏡筒，取下玻片標本2、用紗布把顯微鏡表面擦干3、轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使兩個物鏡伸向前方，將鏡筒緩緩降至最低4、將反光鏡放在直立的位置5、將顯微鏡放回原處第17頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四使用注意事項左手拖鏡座，右手握鏡臂。輕拿輕放。放置：靠光源，靠體前略偏左、鏡筒在前，鏡臂在后。

讓低倍物鏡正對通光孔。轉(zhuǎn)遮光器，讓較大的光圈對準通光孔。第18頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四血球計數(shù)板

是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)，計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。第19頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四血球計數(shù)板第20頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每mL菌液（或每g樣品）中微生物細胞的數(shù)量。計數(shù)公式

1、16格×25格的血球計數(shù)板計算公式：

細胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細胞個數(shù)÷100×400×10000×稀釋倍數(shù)

2、25格×16格的血球計數(shù)板計算公式：

細胞/ml=80小格內(nèi)細胞個數(shù)÷80×400×10000×稀釋倍數(shù)計算方法第21頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四平板計數(shù)法平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。第22頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四三、實驗器皿與材料血球計數(shù)板計數(shù)：顯微鏡、血球計數(shù)板、移液管、酵母菌液（或其他微生物材料）、蓋玻片、擦鏡紙、吸水紙

平板計數(shù)：1．菌種大腸桿菌菌懸液。2．培養(yǎng)基牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。3．儀器或其他用具1mL無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。第23頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四四、實驗步驟1、細胞計數(shù)(1)稀釋：將樣品稀釋至適合的濃度（本實驗用的是酵母菌），一般將樣品稀釋至每一格約有4-5個細胞數(shù)為宜。2、加被測樣品（菌液）至血球計數(shù)板：去洗凈的血球計數(shù)板，將蓋玻片蓋住中間的計數(shù)室，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。血球計數(shù)板計數(shù)第24頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四3、靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強度。4、計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是通常采用五點記數(shù)法。第25頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四5、對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)2-3次，求出每一個小格中細胞平均數(shù)（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數(shù)量。6、

測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內(nèi)保存。第26頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第27頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四注意事項稀釋樣品時應(yīng)使用無菌水避免污染菌液。蓋載玻片時勿使產(chǎn)生氣泡。在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。每個樣品重復(fù)計數(shù)2-3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作）第28頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟平板計數(shù)法l．編號2．稀釋3．取樣4．倒平板5．計數(shù)

第29頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四計數(shù)培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進行計算。每毫升中菌落形成單位=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)第30頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四注意一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復(fù)對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復(fù)對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，減少誤差。三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。第31頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四注意板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調(diào)整。第32頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四微生物的分離純化第33頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗?zāi)康?

了解劃線分離菌種的原理并掌握操作方法2

掌握微生物斜面接種培養(yǎng)的方法和微生物無菌操作計數(shù)第34頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗原理1、平板劃線法是指把雜菌樣品通過在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法，一般是將混雜在一起的不同種微生物或同種微生物群體中的不同細胞，通過在分區(qū)的平板表面做多次劃線稀釋，形成較多的獨立分布的單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)而繁殖成相互獨立的多個單菌落（通常認為這種單菌落就是某個微生物的“純種”）

2、平板劃線分離對細菌、酵母菌較為適宜，而霉菌和放線菌的分離多采用稀釋分離法進行菌種的分離純化。第35頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四倒平板→制備梯度稀釋液→劃線法（或涂布法）→培養(yǎng)→挑單菌落→保存?；韭肪€第36頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四三、儀器與材料1、

菌種：大腸埃希氏菌(Escherichia

coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus

subtilis)的混合培養(yǎng)斜面菌種。2、培養(yǎng)基：伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基。3、器皿：無菌培養(yǎng)皿，水浴鍋，接種環(huán)，培養(yǎng)箱等第37頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四四、實驗步驟

1、融化培養(yǎng)基將裝有伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶放入熱水浴中加熱至沸，直至充分融化。2、倒平板待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右后，按無菌操作法倒平板(每皿約倒15ml)，平置，待凝。第38頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四操作方法：右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用右手手掌和小指將瓶塞輕輕地撥出，瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一條稍大于瓶口的縫隙，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。第39頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四3、做分標志區(qū)

在皿底用記號劃分成4個不同面積的區(qū)域，使A<B<C<D，且各區(qū)的夾角應(yīng)為120°左右，以便使D區(qū)與A區(qū)所劃出的線條相平行、美觀。（如圖）第40頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四4、劃線操作1)挑取菌樣：選用平整、圓滑的接種環(huán)，按無菌操作法挑取少量含菌試樣。

2)先劃A區(qū)：將平板倒置于酒精燈火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并讓平板面向火焰。右手持含菌的接種環(huán)，先在A區(qū)輕巧地劃3~4條連續(xù)的平行線當作初步稀釋的菌源。燒去接種環(huán)上的殘余菌樣。第41頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

3)劃其余區(qū)：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使B區(qū)轉(zhuǎn)至劃線位置，把接種環(huán)通過A區(qū)(菌源區(qū))而移至B區(qū)，隨即在B區(qū)輕巧地劃上6~7條致密的平行線，接著再以同樣的操作在C區(qū)和D區(qū)劃上更多的平行線，并使D區(qū)的線條與A區(qū)平行(但不能與A區(qū)或B區(qū)的線條接觸！)，最后，將左手所持皿底放回皿蓋中。燒去接種環(huán)上的殘菌。

5、恒溫培養(yǎng)將劃線后的平板至37℃倒置培養(yǎng)2~3天6、挑單菌落良好的結(jié)果應(yīng)在C區(qū)出現(xiàn)部分單菌落，而在D區(qū)出現(xiàn)較多獨立分布的單菌落第42頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四7、然后從典型的單菌落中挑取少量菌體至試管斜面，經(jīng)培養(yǎng)后即為初步分離的純種。然后從典型的單菌落中挑取少量菌體至試管斜面，經(jīng)培養(yǎng)后即為初步分離的純種。8、清洗培養(yǎng)皿將廢棄的帶菌平板作煮沸殺菌后進行清洗、晾干。9、保存菌種。第43頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四斜面接種斜面接種是從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一支新鮮斜面。一。實驗步驟：(1)貼標簽接種前在試管上貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口約2-3cm的位置。(2)點燃酒精燈。

(3)接種用接種環(huán)將少許菌種移接到貼好標簽的試管斜面上。操作必須按無菌操作法進行。第44頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四接種的步驟

1)手持試管將菌種和待接斜面的兩支試管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并使它們位于水平位置，如圖。

2)旋松管塞先用有于松動棉塞或塑料管蓋，以便接種時拔出。

3)取接種環(huán)右手拿接種環(huán)(如握鋼筆一樣)，在火焰上將環(huán)端灼燒滅菌。然后將有可能伸入試管的其余部分均灼燒滅菌，重復(fù)此操作，再灼燒一次。第45頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四4)拔管塞用右手的無名指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的管塞，然后讓試管口緩緩過火滅菌(切勿燒得過燙)。見圖所示。接種的步驟第46頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

5)接種環(huán)冷卻將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管，先使環(huán)接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻。

6)取菌待接種環(huán)冷卻后，輕輕沾取少量菌體或胞子，然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使接種環(huán)的部分碰到管壁，取出后不可使帶菌接種環(huán)通過火焰。接種的步驟第47頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

7)接種在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面培養(yǎng)基的底部向上部作“Z”形來回密集劃線，切勿劃破培養(yǎng)基。有時也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條直線作斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長特點。接種的步驟第48頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四接種的步驟8)塞管塞，取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。塞棉塞時不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動時納入不潔空氣。

9)將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。注：盡量選擇獨立的單菌落進行斜面接種，經(jīng)過培養(yǎng)后即得到純菌種斜面。只經(jīng)一次劃線，若有菌種不純，則進行第二次或者數(shù)次劃線后得到純菌種。第49頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四操作圖第50頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四五、注意事項1、為防止平板表面產(chǎn)生冷凝水，倒平板前培養(yǎng)基溫度不能太高。2、用于平板劃線的培養(yǎng)基，瓊脂含量宜高些（2%左右），否則會因平板太軟而被劃破。3、用于劃線的接種環(huán)，環(huán)柄宜長些（約10cm），環(huán)口應(yīng)十分圓滑，劃線時環(huán)口與平板間的夾角宜小些，動作要輕巧，以防劃破平板。4、為了取得良好的劃線效果，可事先用圓紙墊在空培養(yǎng)皿內(nèi)畫上4區(qū)，并用接種環(huán)練習(xí)劃線動作，待通過模擬試驗熟練操作和掌握劃線要領(lǐng)后，再正式進行平板劃線。第51頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四菌種的保藏1、低溫定期移植保藏法。2、液體石蠟保藏法。3、沙土管保藏法。4、濾紙片保藏法。5、自然基質(zhì)保藏法6、生理鹽水保藏法。7、液氮超低溫保藏法。第52頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四低溫定期移植保藏法

適用范圍：適用于大多數(shù)的細菌和真菌。除草菇菌種外，其他食用菌菌種都能采用此法保藏。將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)，當菌絲健壯地長滿斜面時取出，放在3-5℃低溫干燥處或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6個月時間移植轉(zhuǎn)管一次，具體應(yīng)根據(jù)菌種特性決定。保藏時要注意環(huán)境溫度不能太高，以防霉菌通過棉塞進入管內(nèi)。因此，若用棉塞，可用干凈的硫酸紙或牛皮紙包扎棉塞，即可減少污染的機會，也可防止培養(yǎng)基干燥。

第53頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四方法與步驟培養(yǎng)基制備器皿準備培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，根據(jù)不同情況洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。溶解培養(yǎng)基配料先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。第54頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四方法與步驟調(diào)pH值配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸或稀堿調(diào)pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導(dǎo)致測量不準確和營養(yǎng)成分被破壞。加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發(fā)水分。第55頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四方法與步驟過濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝，斜面培養(yǎng)基不宜超過試管高度的四分之一。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，