基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用

基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用課程設(shè)計(jì)目的了解工業(yè)生產(chǎn)中的新型育種技術(shù)并比較不同育種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)；學(xué)習(xí)理解基因工程育種技術(shù)及其操作原理；研究基因工程育種技術(shù)在人干擾素生產(chǎn)中的創(chuàng)新。課程設(shè)計(jì)題目描述與要求本文介紹一種二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來(lái)的一種新型生物技術(shù)——基因工程，介紹其在育種中的應(yīng)用。文中重點(diǎn)介紹了基因工程育種的一般步驟，以及近年來(lái)出現(xiàn)的運(yùn)用基因工程進(jìn)行定向育種的主要新技術(shù)：基因的定點(diǎn)突變，易錯(cuò)PCR，DAN重排及基因組重排。之后，應(yīng)用基因工程育種技術(shù)重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b,通過(guò)優(yōu)化補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達(dá)量和表達(dá)速率。不同的葡萄糖流加方式有各自的優(yōu)點(diǎn),采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表達(dá)量達(dá)到6540mg/L,高于目前已知文獻(xiàn)中hIFNa2b的最高表達(dá)量5200mg/L。三、課程設(shè)計(jì)報(bào)告內(nèi)容引言基因工程是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來(lái)的一種新型生物技術(shù)，其發(fā)展從根本上改變了生物技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用模式。1972年美國(guó)的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV40DNA、λ噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。翌年，美國(guó)斯坦佛大學(xué)的Cohen和Boyer等人在體外構(gòu)建出含有四環(huán)素和鏈霉素連個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌后，該重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞相應(yīng)的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕生。在二十世紀(jì)八十年代以來(lái)，隨著大批大批成果的出現(xiàn)及應(yīng)用，基因工程帶來(lái)了一場(chǎng)新的革命。利用這些技術(shù)，可以直接地、有針對(duì)性地在DNA分子水平上改造生物的遺傳性狀。通過(guò)轉(zhuǎn)入外源基因，微生物和動(dòng)、植物細(xì)胞可以產(chǎn)生出自身原來(lái)沒(méi)有的蛋白質(zhì)。同樣，利用重組DNA技術(shù)，也可以使一些原來(lái)存在量極低但有重要工業(yè)或醫(yī)學(xué)用途的小分子(抗生素)或蛋白質(zhì)之外的大分子物質(zhì)得以大量生產(chǎn)。特別是隨著重組DNA技術(shù)的完善和發(fā)展，以基因水平為核心的現(xiàn)代分子定向育種技術(shù)越來(lái)越受到工業(yè)微生物育種學(xué)家的關(guān)注，并展示了良好的應(yīng)用前景。1、基因工程育種基因工程育種是在基因水平上，運(yùn)用人為方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，與載體連接，然后導(dǎo)入另一細(xì)胞，使外源遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行正常復(fù)制和表達(dá)引，與前幾種育種技術(shù)相比，基因工程育種技術(shù)是人們?cè)诜肿由飳W(xué)指導(dǎo)下的一種自覺(jué)的、能像工程一樣可預(yù)先設(shè)計(jì)和控制的育種新技術(shù)，它可實(shí)現(xiàn)超遠(yuǎn)緣雜交，因而是最新最有前途的一種育種新技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的全部過(guò)程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段與基因載體的體外連接、外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞和目標(biāo)基因的表達(dá)等主要環(huán)節(jié)。1.1基因工程育種的一般步驟是：(1)目的基因的獲得：一般通過(guò)化學(xué)合成法、物理化學(xué)法(包括密度梯度離心法、單鏈酶法、分子雜交法)、鳥(niǎo)槍無(wú)性繁殖法、酶促合成法(逆轉(zhuǎn)錄法)、Norther雜交分析法、cDNA文庫(kù)篩選法、雜交篩選法、編碼序列富集(磁珠捕獲)、產(chǎn)物導(dǎo)向法、Nod連接片段篩選法、外顯子捕獲法及外顯子擴(kuò)增法、剪接位點(diǎn)篩選法、作圖克隆法、雜交細(xì)胞克隆法、消減雜交法、相同序列克隆法、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR法、顯微克隆與微克隆法和插入誘變法等方法獲得目的基因。(2)載體的選擇：基因工程載體主要是質(zhì)粒和病毒，載體一般為環(huán)狀DNA，其要求有自我復(fù)制能力、分子小、拷貝數(shù)多、易連接和易篩選等特點(diǎn)。(3)重組子體外構(gòu)建：主要方法有粘性末端連接法、平端連接法、人工接頭連接法和同聚物加尾連接法。(4)重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞：其主要途徑有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、電穿孔法、快速冷凍法和炭化纖維介導(dǎo)法等。(5)重組體篩選和鑒定：以合適的篩選方法選擇具有最佳性能的突變重組子，重組體篩選和鑒定主要通過(guò)表型法、DNA鑒定篩選法，選擇性載體篩選法、分子雜交選擇法、免疫學(xué)方法和mRNA翻譯檢測(cè)法等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。1.2運(yùn)用基因工程進(jìn)行定向育種的新技術(shù)1．2.1基因的定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變(site—specificmutagenesis或site—directedmutagenesis)是指在目的DNA片斷(例如：一個(gè)基因)的指定位點(diǎn)引入特定的堿基對(duì)的技術(shù)，其包括寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、盒式誘變以及以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變。近十年來(lái)，定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，并且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了很多新技術(shù)。例如：重疊延伸PCR法(OverlapExtensionPCR簡(jiǎn)稱EO—PCR)、大引物PCR法(MegaprimerPCR)、一步重疊延伸PCR(One—stepOverlapExtensionPCR，簡(jiǎn)稱OOE．PCR)、單管大引物PCR(Single—tubeMegaprimerPCR)、快速定點(diǎn)誘變法、多位點(diǎn)環(huán)狀誘變法TAMS(TargetedAmplificationofMutantStrand)定點(diǎn)誘變技術(shù)。在這些技術(shù)中，單管大引物PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)最為簡(jiǎn)單和適用，并得到廣泛的應(yīng)用。單管大引物PCRPicard等和HKe等分別建立了單管大引物PCR法。該法省去了傳統(tǒng)上以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變中第1輪PCR產(chǎn)物的純化過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)的定點(diǎn)突變目標(biāo)。在上述2組研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、簡(jiǎn)單(圖1)。其只需設(shè)計(jì)Tm值不同的2個(gè)側(cè)引物，在第1輪PCR反應(yīng)中用Tm值低的側(cè)引物(F1)和誘變引物，在較低的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大引物；然后再加入Tm值高的側(cè)引物(F2)，在較高的退火溫度下進(jìn)行第2輪反應(yīng)，擴(kuò)增出含突變位點(diǎn)的整個(gè)DNA產(chǎn)物。Ke等在此方法中還提出了2條更為細(xì)致、有效的改進(jìn)措施，使PCR產(chǎn)物的最終產(chǎn)量和純度均有所提高。這2條改進(jìn)措施為：(1)在第1輪PCR反應(yīng)中，誘變引物的濃度僅為側(cè)引物的1％，以減少誘變引物在第2輪PCR中的干擾作用；(2)在第l輪PCR反應(yīng)后，亦即第2輪PCR反應(yīng)前，增加5個(gè)循環(huán)的不對(duì)稱擴(kuò)增，這有利于提高其后的擴(kuò)增效率。這種單管大引物法的優(yōu)點(diǎn)是：實(shí)現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，大幅簡(jiǎn)化了操作步驟，并且省時(shí)、省力。在對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行操作時(shí)，該方法的優(yōu)點(diǎn)更為突出。在以PCR為基礎(chǔ)的誘變方法中，該法是引入單位點(diǎn)突變最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的方法。圖1單管大引物PCR過(guò)程Figure1TheprocessofSingle·tubemegaprimerPCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)2003年，Young等報(bào)道了一種有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈的定點(diǎn)誘變技術(shù)(Targetedamplificationofmutantstrand，TAMS)。該技術(shù)能夠一次引入多個(gè)位點(diǎn)的突變，并且能夠有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈，從而使突變效率幾乎達(dá)到100％。該方法主要分3步(圖2)：(1)線性單鏈DNA模板的制備：通過(guò)線性PCR制備單鏈DNA模板；(2)突變鏈的合成：該步驟需用2個(gè)錨錠引物(即Anchor5和Anchor3)和多個(gè)誘變引物(Mut1和Mut2)。(3)有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈：設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(PCR5和PCR3)，使其3′端堿基分別與錨錠引物引入的突變堿基配對(duì)，擴(kuò)增引物只能退火到突變鏈而不是親本鏈。在多位點(diǎn)的突變?cè)囼?yàn)中，TAMS誘變技術(shù)應(yīng)該是首選方法。定點(diǎn)突變技術(shù)已在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定點(diǎn)突變改變酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。圖2TAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)原理和操作過(guò)程Figure2TheprincipleandoperationprocessofTAMS1．2.2易錯(cuò)PCRDNA聚合酶在進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA時(shí)會(huì)以一定的頻率發(fā)生堿基錯(cuò)配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對(duì)特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的可能方法。利用PCR過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯(cuò)PCR(Error_pronePCR，簡(jiǎn)稱EP—PCR)。此方法的原理與操作如圖3，其操作過(guò)程是在TaqDNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)體系中，利用Mn替代天然的輔助因子Mg，使TaqDNA聚合酶缺乏校對(duì)活性，同時(shí)使反應(yīng)體系中各種dNTP的比例失衡，因此導(dǎo)致堿基的錯(cuò)配率大大增加，通常約為0.1％。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來(lái)控制錯(cuò)配水平。這種方法可以將錯(cuò)配率最大提高至20％?？讟s等利用易錯(cuò)PCR使D-海因酶對(duì)底物的水解活性提高了2.4倍；黃瑛等用易錯(cuò)PCR使短小芽孢桿菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH>8.0時(shí)的穩(wěn)定性也較野生型脂肪酶有所提高。圖3易錯(cuò)PCR示意圖Figure3Sketchoferror-pronePCR1．2.3DAN重排DNA重排(DNAshufling)技術(shù)是一種利用重組文庫(kù)的體外定向進(jìn)化技術(shù)，Stemmer于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先將同源基因(單一基因的突變體或基因家族)切成隨機(jī)大小的DAN片段，然后進(jìn)行PCR重聚。那些帶有同源性和核苷酸序列差異的隨機(jī)DAN片段在每一輪循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)過(guò)多次PCR循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組DNA，從而創(chuàng)造出新基因。其操作的原理和步驟如圖4。圖4DNA重排的原理及操作步驟Figure4TheprincipleandoperationprocessofDNAshufflingZhao等在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種更加簡(jiǎn)化交叉延伸程序(STEP)(圖5)。此技術(shù)是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中以2個(gè)以上相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物先在一個(gè)模板鏈上延伸，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性(延伸)過(guò)程。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地與含不同突變的模板進(jìn)行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長(zhǎng)基因片段，重組的程度可以通過(guò)調(diào)整時(shí)間和溫度來(lái)控制。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進(jìn)一步簡(jiǎn)化。圖5交叉延伸程序的基本過(guò)程Figure5Basicprocedureofstaggeredextensionprocess近幾年來(lái)，提高DNA重排技術(shù)捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI對(duì)靶序列進(jìn)行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術(shù)（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴(kuò)大了該技術(shù)的用途。Hiraga等開(kāi)發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識(shí)別標(biāo)記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNaseI產(chǎn)生重排片段。Bergquist等開(kāi)發(fā)的DOGS技術(shù)則是根據(jù)保守模體區(qū)序列特征設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增出保守同源區(qū)后再用重排操作生成突變富集體。由于此方法是在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。DNA重排的最大特點(diǎn)是在反復(fù)突變過(guò)程中引進(jìn)了重組這一自然進(jìn)化中最重要的過(guò)程，而且其對(duì)可操作的靶序列的長(zhǎng)度沒(méi)有任何要求，可以達(dá)到幾萬(wàn)kb。通過(guò)多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高，同時(shí)還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。1．2.4基因組重排基因組重排(genomeshufling)技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀(jì)出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對(duì)象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對(duì)菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。首先，利用經(jīng)典的誘變育種技術(shù)獲得含有目標(biāo)性狀的基因組庫(kù)，然后利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進(jìn)行多輪隨機(jī)重組，從而快速篩選表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體-融合-再生-再制成原生質(zhì)體-融合-再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursiveprotoplastfusion)的方法。Zhang等于2002年首次報(bào)道應(yīng)用基因組重排方法快速地使弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)產(chǎn)生泰樂(lè)菌素的能力得到提高。該方法以營(yíng)養(yǎng)缺陷型為出發(fā)菌株，僅用了1年時(shí)間，通過(guò)兩輪基因組改組就從24000株菌株中分離到2組共14株泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株，其泰樂(lè)菌素產(chǎn)量高于通過(guò)經(jīng)典誘變育種方法所篩得的生產(chǎn)菌株SF21，而后者(SF21)是用經(jīng)典誘變育種方法在長(zhǎng)達(dá)20年的時(shí)間中先后篩選過(guò)約1000000個(gè)菌株后才獲得的。由此可見(jiàn)，此技術(shù)大大減少了工作量，并縮短了篩選時(shí)間。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標(biāo)記特征，應(yīng)用基因組重排的方法在一年之內(nèi)使替考拉寧產(chǎn)量提高了65.3％。除上述技術(shù)外，近年來(lái)又出現(xiàn)了一些新技術(shù)，例如：部分基因片段改組、單鏈DNA家族改組(SSDNAs)、簡(jiǎn)并引物基因改組(DOGS)、瞬時(shí)模板的隨機(jī)嵌合、單向引物的隨機(jī)重組、自我復(fù)制、體外隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)、酶法體外隨機(jī)-定位誘變(random—site—directedmutagenesis)、交錯(cuò)延伸剪接PCR等。2、基因工程育種技術(shù)在大腸桿菌種的應(yīng)用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細(xì)菌，其K-12MG1655株的4000多kb的染色體DNA已測(cè)序完畢，全基因共含有4405個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。作為一種成熟的基因克隆表達(dá)受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如基因的分離擴(kuò)增、DNA序列分析、基因的表達(dá)產(chǎn)物功能鑒定等。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。因此，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌工程菌，以規(guī)?；a(chǎn)真核生物基因尤其是人類基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?，F(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過(guò)大腸桿菌基因工程菌實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長(zhǎng)激素、人干擾素、人白細(xì)胞介素和抗體。以下以生產(chǎn)人干擾素為例介紹其應(yīng)用。人干擾素a2b(HumanInterferona2b,hIFNa2b)是由165個(gè)氨基酸組成的多肽,具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)損傷等作用。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對(duì)肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快速、發(fā)酵成本低、表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn),是生產(chǎn)外源蛋白的理想表達(dá)體系。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵過(guò)程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生長(zhǎng),提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實(shí)現(xiàn)高密度高表達(dá)的關(guān)鍵。本文采用大腸桿菌BL21(pBAI)表達(dá)hIFNa2b,其表達(dá)通過(guò)溫控型PL啟動(dòng)子調(diào)控?？疾炝搜a(bǔ)料方式對(duì)hIFNa2b生產(chǎn)速率的影響,hIFNa2b表達(dá)水平達(dá)到6540mg/L。2.1材料與方法2.1.1材料菌株宿主菌E.coliBL21(DE3)[BF-dcmompThsdS(r-Bm-B)galλ(DE3)],重組質(zhì)粒為pBAI,帶有氨芐青霉素耐藥性標(biāo)記,hIFNa2b基因表達(dá)受λPL啟動(dòng)子和質(zhì)粒cI857編碼的蛋白調(diào)控。培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L,酵母抽提物5g/L,NaCl10g/L),滅菌后加入100mg/L氨芐青霉素鈉。分批發(fā)酵培養(yǎng)基為含葡萄糖5g/L的LB培養(yǎng)基。未特別注明的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5g/L的2×LB培養(yǎng)基(蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,NaCl10g/L),補(bǔ)料液為400g/L的葡萄糖。培養(yǎng)基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均為Oxoid產(chǎn)品,其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純,采用去離子水配制。2.1.2培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)從-20°C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入裝有30ml種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶,于搖床200r/min,30°C下培養(yǎng)10h,為一級(jí)種子;將一級(jí)種子以1.5%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵罐培養(yǎng)將二級(jí)種子以6%的接種量接入5L發(fā)酵罐(RIBE-5型)中。培養(yǎng)液裝量為2.5L，生長(zhǎng)階段控制溫度30°C,表達(dá)階段控制溫度42°C，發(fā)酵過(guò)程中控制pH為7.0,通氣量4L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min,發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)速逐漸提高以維持溶氧大于20%。補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應(yīng)速率流加。恒pH方式為當(dāng)pH超過(guò)7.0時(shí)自動(dòng)補(bǔ)入葡萄糖；恒速流加以5.4g/(L·h)的速率流加葡萄糖；恒比供應(yīng)速率(QG)為0.27g/(g2.1.3測(cè)定方法菌體濃度測(cè)定采用濁度法,測(cè)定波長(zhǎng)600nm處的光密度(OD600),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體干重。葡萄糖測(cè)定采用葡萄糖測(cè)定試劑盒(上海科欣生物技術(shù)研究所)測(cè)定。乙酸測(cè)定采用氣相色譜法[5]。hIFNa2b的電泳測(cè)定采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(φ=0.15)-SDS-聚丙烯酰胺三層膠系統(tǒng)分離目的蛋白[6],凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色,用圖像分析系統(tǒng)(SmartViewanalysisprogram,上海復(fù)日科技有限公司)定量。取發(fā)酵液于12000r/min,4°C下離心10min,得到的菌體用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L,pH7.0,4°C)洗滌,然后溶于上樣緩沖液中[12mmol/L、pH6.8Tris-HCl,甘油(φ=0.05),SDS(7.5g/L),巰基乙醇(2.2結(jié)果與討論2.2.1分批發(fā)酵在5L罐中分批培養(yǎng),結(jié)果見(jiàn)圖6和表1。培養(yǎng)2.5h升溫誘導(dǎo),此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,升溫對(duì)于菌體生長(zhǎng)的影響并不顯著,表達(dá)初期菌體比生長(zhǎng)速率較升溫前略有下降。分批發(fā)酵中葡萄糖耗完時(shí),乙酸積累達(dá)到最大值1.1g/L。hIFNa2b的表達(dá)水平達(dá)到749mg/L,是相同培養(yǎng)基條件下?lián)u瓶培養(yǎng)的2.9倍。誘導(dǎo)后1h,hIFNa2b比生產(chǎn)速率為162mg/(g·h),生產(chǎn)速率為275mg/(L·h)；誘導(dǎo)后期比生產(chǎn)速率下降至95mg/(g·h),但由于菌體濃度增大,生產(chǎn)速率達(dá)到363mg/(L·h)。圖6分批培養(yǎng)時(shí)菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線Fig.6Profilesofdrycellweight(◆),residualglucose(■),aceticacid(●)andhIFNa2b(▲)inbatchcultivation葡萄糖流加對(duì)于hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響要獲得hIFNa2b的高體積表達(dá)水平,則需維持較高的比生產(chǎn)速率,并且增大菌體密度,流加葡萄糖是一種很好的選擇。恒pH流加葡萄糖培養(yǎng)4h后升溫誘導(dǎo)表達(dá)hIFNa2b,此時(shí)殘?zhí)菨舛葹?.9g/L。6h時(shí)初始葡萄糖耗盡,溶氧迅速回升,開(kāi)始用恒pH法補(bǔ)加葡萄糖,即pH高于設(shè)定值時(shí)蠕動(dòng)泵自動(dòng)加入葡萄糖溶液1s。此補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)記為FB1,結(jié)果見(jiàn)圖7圖7恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)(FB1)中菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線Fig.7Profilesofdrycellweight(◆),residualglucose(■),aceticacid(●)andhIFNa2b(▲)inpH-statfed-batchcultivation(FB1)hIFNa2b表達(dá)量在11.5h達(dá)到2400mg/L,是分批發(fā)酵的3.2倍。誘導(dǎo)初期的2h內(nèi),hIFNa2b比生產(chǎn)速率為148mg/(g·h),生產(chǎn)速率高達(dá)730mg/(L·h)。后期hIFNa2b表達(dá)速率明顯減慢,發(fā)酵末期僅為10mg/(g·h)。在恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)中,能較好地控制葡萄糖的流加,使得發(fā)酵后期沒(méi)有乙酸積累。但是恒pH流加方式下的葡萄糖流加是基于有機(jī)氮源的異化代謝引起pH上升,隨著培養(yǎng)基的氮源如氨基酸的逐漸消耗,減少了氨離子的產(chǎn)生,從而不易引起發(fā)酵液pH上升,導(dǎo)致葡萄糖補(bǔ)加速率的降低,使得培養(yǎng)過(guò)程中特別是發(fā)酵后期葡萄糖的供應(yīng)不足。如圖8所示,培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖流加速率rG從2.83g/h下降到1.99g/h,葡萄糖比消耗速率QG從0.115g/(g·h)下降到0.087g/(g·h),限制了hIFNa2b的表達(dá)。與分批培養(yǎng)相比,雖然hIFNa2b的比生產(chǎn)速率有所下降,但總產(chǎn)量和菌體hIFNa2b含量大幅提高,說(shuō)明菌體濃度升高有利于提高h(yuǎn)IFNa2b表達(dá)水平,恒pH流加是一種操作方便的流加方式。圖8恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)(FB1)中葡萄糖濃度(■)、葡萄糖流加速率(◆)及葡萄糖比消耗速率(▲)的變化曲線Fig.8Profilesofresidualglucose(■),feedingrateofglu-cose(◆)andspecificconsumptionrateofglucose(▲)inpH-statfed-batchcultivation(FB1)恒速補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中hIFNa2b平均生產(chǎn)速率是恒pH補(bǔ)料時(shí)的1.65倍,表明葡萄糖供應(yīng)的改善提高了hIFNa2b的表達(dá)水平,盡管葡萄糖的比消耗速率還是從誘導(dǎo)初期的0.28g/(g·h)下降到0.21g/(g·h)。因?yàn)槠谕_(dá)到較高的菌體密度,所以生長(zhǎng)期較長(zhǎng)。誘導(dǎo)前培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗較多,8.5h時(shí)菌體的比生長(zhǎng)速率已經(jīng)降低到0.203h-1,升溫誘導(dǎo)后1h,比生長(zhǎng)速率更降低至0.074h-1,營(yíng)養(yǎng)消耗導(dǎo)致hIFNa2b的比生產(chǎn)速率僅27mg/(g·h),大大低于恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)FB1。通過(guò)恒速補(bǔ)糖方式取得了hIFNa2b非常高的表達(dá)量,但這是通過(guò)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間和提高菌體濃度實(shí)現(xiàn)的,過(guò)低的比生產(chǎn)速率大大影響發(fā)酵生產(chǎn)效率。2.3誘導(dǎo)前添加有機(jī)氮源對(duì)hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響許多基因工程菌外源基因的表達(dá)顯示出與生長(zhǎng)速率相關(guān)的特性,而補(bǔ)料分批培養(yǎng)中,隨著菌體濃度的提高,誘導(dǎo)初期的比生長(zhǎng)速率明顯下降,反映了營(yíng)養(yǎng)的限制。因此在誘導(dǎo)前1.5h補(bǔ)充有機(jī)氮源(酵母提取物25g),以滿足菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的需要。初始葡萄糖耗完后,采用恒比供應(yīng)速率(0.27g/(g·h))的方式補(bǔ)充葡萄糖,發(fā)酵過(guò)程記為FB3,結(jié)果見(jiàn)圖9和表1。圖9補(bǔ)料分批培養(yǎng)FB3中菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線Fig.9Profilesofdrycellweight(◆),residualglucose(■),aceticacid(●)andhIFNa2b(▲)infed-batchcultivationFB3(yeastextractwasaddedat6.5h)采用恒比供應(yīng)速率流加方式,葡萄糖流速根據(jù)菌體總量變化而變化,能夠較好地滿足細(xì)胞代謝及重組蛋白表達(dá)所需的能量需求,同時(shí)也避免了乙酸和殘?zhí)堑姆e累,平均比生產(chǎn)速率為恒速流加時(shí)的2倍。可以看出,加入酵母抽提物,滿足了菌體生長(zhǎng)的需要,使得誘導(dǎo)前后均有較高的比生長(zhǎng)速率,表達(dá)期平均比生長(zhǎng)速率達(dá)到0.106h-1。升溫誘導(dǎo)5.5h后,hIFNa2b表達(dá)量即達(dá)到5530mg/L,hIFNa2b最大比生產(chǎn)速率為124mg/(g·h),hIFNa2b的平均生產(chǎn)速率大幅提高,達(dá)1006mg/(L·h)。分批發(fā)酵和不同補(bǔ)料分批發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納于表1?？梢钥闯鯢B3添加的酵母提取物提供了氨基酸和核苷酸,有利于外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,使hIFNa2b合成速率加快,hIFNa2b對(duì)于有機(jī)氮源的得率最高,是FB2的1.27倍,并且發(fā)酵周期僅13.5h,較FB2的20.5h大大縮短了時(shí)間,提高了hIFNa2b的生產(chǎn)速率,一次性添加有機(jī)氮源的操作也比較便捷,在生產(chǎn)上有一定的應(yīng)用價(jià)值。1)DCWatthebeginningofinductionb；2)DCWattheendofculture3)During1hpostinduction；4)OverallproductivityofhIFNa2b；5)OverallspecificproductivityofhIFNa2b；6)HIFNa2byieldbasedontotalcomplexnitrogensources；7)SpecifichIFNa2bproduction3結(jié)論目前hIFNα2b在臨床的應(yīng)用廣泛,需求量大,但由于生產(chǎn)水平的限制,價(jià)格仍舊較高。本文通過(guò)優(yōu)化補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達(dá)量和表達(dá)速率。分批培養(yǎng)時(shí)乙酸積累,對(duì)hIFNa2b表達(dá)有一定抑制作用,流加葡萄糖的策略使得表達(dá)期無(wú)乙酸積累,提高了hIFNa2b的表達(dá)水平。不同的葡萄糖流加方式有各自的優(yōu)點(diǎn),采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表達(dá)量達(dá)到6540mg/L,高于目前已知文獻(xiàn)中hIFNa2b的最高表達(dá)量5200mg/L。恒比供應(yīng)速率流加葡萄糖并在誘導(dǎo)前添加酵母抽提物,雖然總表達(dá)量5530mg/L,稍低于恒速流加方式,但是平均hIFNa2b生產(chǎn)速率高達(dá)1006mg/(L·h),是分批培養(yǎng)時(shí)的3.08倍,是恒速流加方式時(shí)的1.84倍,并且對(duì)有機(jī)氮源的得率提高到138mg/g,大大縮短了發(fā)酵時(shí)間,為該表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用創(chuàng)造了條件。參考文獻(xiàn)：[1]張惠展.基因工程.上海:華東理工大學(xué)出版社,2005,8[2]朱筠,李志敏,張倩,甘人寶,葉勤.重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b.華東理工大學(xué)學(xué)報(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附錄資料：不需要的可以自行刪除制定生產(chǎn)計(jì)劃的常用方法一、圖表法[例13-1]已知H公司1999年上半年（為簡(jiǎn)化，只考慮上半年）滿足需求量的生產(chǎn)安排，見(jiàn)表13-5。為實(shí)現(xiàn)此進(jìn)度安排，擬采用三種不同的綜合生產(chǎn)計(jì)劃方案。表13-5H公司1999年上半年生產(chǎn)進(jìn)度安排單位：臺(tái)序號(hào)項(xiàng)目名稱1月2月3月4月5月6月12345678期初庫(kù)存量預(yù)測(cè)需求量累計(jì)需求量保險(xiǎn)儲(chǔ)備量生產(chǎn)需要量(2)+(4)-(1）累計(jì)生產(chǎn)量有效工作日（天）累計(jì)工作日（天）400180018004501850185025254501500330037514253275224737511004400275100042752471275900530022585051252495225110064002751150627525120275170081004251850812523143*保險(xiǎn)儲(chǔ)備量=1/4預(yù)測(cè)需求量有關(guān)成本數(shù)據(jù)補(bǔ)充如下：生產(chǎn)成本=100元/件；存儲(chǔ)費(fèi)用=每月生產(chǎn)成本的1.5%（即每月每件1.5元）；標(biāo)準(zhǔn)工資率=每小時(shí)4元；加班費(fèi)=標(biāo)準(zhǔn)工資的150%或每小時(shí)6元；缺貨損失=5元/件；外協(xié)比自制昂貴而增加的費(fèi)用=每件產(chǎn)品2元；招聘和培訓(xùn)費(fèi)=每人200元；提前解聘損失費(fèi)=每人250元；每件產(chǎn)品所需工時(shí)=5小時(shí)。方案1的策略：在正常工作班次下，通過(guò)增減生產(chǎn)工人來(lái)生產(chǎn)出確切的需要量。方案2的策略：固定生產(chǎn)工人數(shù)，工人數(shù)按6個(gè)月的平均產(chǎn)量來(lái)確定（（8125件×5小時(shí)/件）/（143天×8小時(shí)/天）=36人）；允許庫(kù)存發(fā)生短缺，通過(guò)下月的生產(chǎn)來(lái)補(bǔ)足。方案3的策略：按生產(chǎn)需要量（計(jì)劃量）最低的4月份來(lái)確定所需工人數(shù)，并穩(wěn)定在4月份這個(gè)水平上（（850件×6月×5小時(shí)/件）/（143天×8小時(shí)/天）=22人；產(chǎn)量低于需求量部分通過(guò)外協(xié)來(lái)解決。計(jì)劃方案見(jiàn)表13-6方案1：11600元方案2：7460元方案3：6182元

表13-6三種方案的計(jì)算序號(hào)月份（1）計(jì)劃產(chǎn)量（2）所需工時(shí)(1)×5（3）每人每月工時(shí)數(shù)(天數(shù)×8)（4）所需工人數(shù)(2)/(3)（5）增加工人數(shù)（6）增加工人的支出（7）減少工人數(shù)（8）解聘損失費(fèi)方案11234561850142510008501150185092507125500042505750925020017619219220018446402622295000007210000140042000614400015003500100000合計(jì)56006000月份（1）累計(jì)計(jì)劃產(chǎn)量（2）有效生產(chǎn)工時(shí)（3）能力產(chǎn)量（4）累計(jì)能力產(chǎn)量（5）不足的產(chǎn)量（6）缺貨損失（7）過(guò)剩產(chǎn)量（8）庫(kù)存費(fèi)用方案212345618503275427551256275812572006336691269127200662414401267138213821440132514402707408954716911823641056818620502840930346636111519954167合計(jì)58201640月份（1）計(jì)劃產(chǎn)量（2）有效生產(chǎn)工時(shí)（3）能力產(chǎn)量（4）外協(xié)數(shù)量（5）外協(xié)費(fèi)用方案3123456185014251000850115018504400387242244224440040488807748458458808109706511555270104019401302310105402080合計(jì)81256182表13-7三種方案的比較費(fèi)用變化方案1方案2方案3變動(dòng)工人數(shù)，生產(chǎn)確切的需要量固定工人數(shù)，變動(dòng)庫(kù)存量，允許缺貨保持最低限度人數(shù)，不足量外協(xié)增加工人數(shù)的支出解聘損失費(fèi)超儲(chǔ)費(fèi)用缺貨損失外協(xié)費(fèi)560060000000016405820000006182總成本1160074606182二、運(yùn)輸表法運(yùn)輸表法的基本假設(shè)是：1.每一單位計(jì)劃期內(nèi)正常生產(chǎn)能力、加班生產(chǎn)能力以及外協(xié)量均有一定限制；2.每一單位計(jì)劃期的預(yù)測(cè)需求量是已知的；3.全部成本都與產(chǎn)量呈線性關(guān)系。表13-8用圖表法求解的綜合生產(chǎn)計(jì)劃單位：萬(wàn)臺(tái)計(jì)劃方案計(jì)劃期1計(jì)劃期2計(jì)劃期3計(jì)劃期4未用生產(chǎn)能力總生產(chǎn)能力單位計(jì)劃期期初庫(kù)存0h2h3hI01正常生產(chǎn)rr+hr+2hr+3hR1加班生產(chǎn)cc+hc+2hc+3hOT1外協(xié)ss+hs+2hs+3hS12正常生產(chǎn)×rr+hr+2hR2加班生產(chǎn)×cc+hc+2hOT2外協(xié)×ss+hs+2hS23正常生產(chǎn)××rr+hR3加班生產(chǎn)××cc+hOT3外協(xié)××ss+hS34正常生產(chǎn)×××rR4加班生產(chǎn)×××cOT4外協(xié)×××sS4需求D1D2D3D4h──單位計(jì)劃期內(nèi)單位產(chǎn)品的庫(kù)存成本I0──第1期期初庫(kù)存r──單位產(chǎn)品的正常生產(chǎn)成本Rt──t期的正常生產(chǎn)能力c──單位產(chǎn)品的加班成本OTt──t期的加班生產(chǎn)能力S──單位產(chǎn)品的外協(xié)成本St──t期的外協(xié)生產(chǎn)能力Dt──t期的預(yù)測(cè)需求量

[例13-2]M公司生產(chǎn)某種產(chǎn)品，該產(chǎn)品的需求具有波動(dòng)性，其需求預(yù)測(cè)和有關(guān)成本數(shù)據(jù)如表13-9所示。該公司現(xiàn)在打算根據(jù)表13-9和表13-11所列的生產(chǎn)能力計(jì)劃來(lái)制定綜合生產(chǎn)計(jì)劃,公司現(xiàn)有庫(kù)存為250萬(wàn)臺(tái)。按照公司的經(jīng)營(yíng)方針，希望期末庫(kù)存為300萬(wàn)臺(tái)，且不允許任務(wù)積壓和庫(kù)存缺貨。表13-9各期的需求預(yù)測(cè)值單位:萬(wàn)臺(tái)季度1季度2季度3季度4季度合計(jì)需求30085015003002950表13-10各項(xiàng)成本數(shù)據(jù)項(xiàng)目成本單位產(chǎn)品的庫(kù)存成本單位產(chǎn)品的正常生產(chǎn)成本單位產(chǎn)品的加班生產(chǎn)成本單位產(chǎn)品的外協(xié)成本0.3元/季度1.00元1.50元1.90元表13-11生產(chǎn)能力計(jì)劃單位:萬(wàn)臺(tái)項(xiàng)目1季度2季度3季度4季度正常生產(chǎn)450450750450加班生產(chǎn)909015090外協(xié)200200200200利用圖表方法來(lái)解決這一問(wèn)題，表13-12