DB32T 3762.2-2020新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第2部分：病毒分離與鑒定

ICS11.020C2江蘇省地DB32方標(biāo)準(zhǔn)DB/T3762.2—2020TechnicalspecificationsforSARSCoV-2detectionPartVirusisolationandidentification江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前言BTGB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出。。與消毒。本部分適用于新型冠狀病毒感染患者各類臨床樣本中新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的分離培養(yǎng)，。范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)定義文件4環(huán)境與設(shè)施質(zhì)，并需在生物安全三級(jí)(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。設(shè)備與耗材5.1設(shè)備5.2耗材一次性平皿、剪刀、鑷子、聚四氟乙烯研磨器(塑料)、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶/細(xì)胞管、移液器、與材料臨床樣本呼吸道樣本：咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等。尸體解剖組織樣本。.2試劑6.2.1Hanks溶液(每毫升含青、鏈霉素各2000單位)。6.2.2DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)。6.2.3DMEM維持液(含2%胎牛血清)。a.3細(xì)胞非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(VERO-E6)、人肝癌細(xì)胞(Huh7)等。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備7.1.1將實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層。樣本處理呼吸道樣本及肛拭子a)在生物安全柜內(nèi)渦旋震蕩裝有呼吸道樣本(咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等)及肛拭子的采樣b)將上述處理過(guò)的樣本4℃，4000rpm，離心5min，以去除雜質(zhì)。肺組織樣本%in血液樣本a0%~20%加入青鏈霉素，置4℃冰箱處理樣本4~6小時(shí)或過(guò)夜。接種病毒7.4細(xì)胞病變(CPE)觀察與培養(yǎng)物收集鑒定7.4.1細(xì)胞病變(CPE)觀察按上述方法樣本接種細(xì)胞后，每24h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(CPE)：以0%~25%細(xì)胞CPE變化為“+”，26%~50%細(xì)胞CPE變化為“++”，51%~75%細(xì)胞CPE變化為“+++”，76%~100%細(xì)胞培養(yǎng)物收集收集的培養(yǎng)物需反復(fù)凍融三次，4℃，4000rpm，離心15min，收集上清。養(yǎng)結(jié)果鑒定b)分離培養(yǎng)物進(jìn)