微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)三

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)三第1頁(yè)/共33頁(yè)實(shí)驗(yàn)三

抗酸染色

病毒的接種與培養(yǎng)

真菌菌落形態(tài)觀察第2頁(yè)/共33頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握抗酸染色方法。2.了解抗酸染色的原理和意義。

抗酸染色

Acidfaststain第3頁(yè)/共33頁(yè)分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過(guò)加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間來(lái)促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用3%鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。二、實(shí)驗(yàn)原理第4頁(yè)/共33頁(yè)

細(xì)菌：卡介苗（BacillusCalmette-Guerin，BCG）染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等

三、實(shí)驗(yàn)材料第5頁(yè)/共33頁(yè)1、細(xì)菌涂片的制備

涂片干燥固定

2、染色1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開(kāi)，加熱3～5min，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色：

3%鹽酸酒精脫色30s～1min；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1min；用水沖洗后用吸水紙吸干。四、方法與步驟第6頁(yè)/共33頁(yè)五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果未染色

初染后脫色后復(fù)染后初染脫色復(fù)染石炭酸復(fù)紅鹽酸酒精堿性美蘭第7頁(yè)/共33頁(yè)

結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無(wú)序，偶呈分枝狀生長(zhǎng)。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。第8頁(yè)/共33頁(yè)六、注意事項(xiàng)1、無(wú)菌操作2、染色時(shí)間3、初染加熱的溫度，勿沸騰第9頁(yè)/共33頁(yè)病毒的接種與培養(yǎng)

真菌菌落形態(tài)觀察

第10頁(yè)/共33頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠《镜呐囵B(yǎng)方法掌握病毒的雞胚接種及動(dòng)物接種了解常見(jiàn)真菌的菌落特點(diǎn)第11頁(yè)/共33頁(yè)一.病毒的培養(yǎng)動(dòng)物接種法雞胚培養(yǎng)法組織細(xì)胞培養(yǎng)法病毒的分離培養(yǎng)

病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏完整的酶系統(tǒng)，不能在無(wú)生命的人工培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，必須在活的組織細(xì)胞中才能增殖。第12頁(yè)/共33頁(yè)1.動(dòng)物接種（Animalinoculation）最早應(yīng)用的病毒培養(yǎng)法。用途：分離鑒定、傳代、制備免疫血清。缺陷：帶菌，缺敏感動(dòng)物。常用動(dòng)物：鼠、家兔、猴和羊等。接種的途徑：腦內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)和靜脈注射等。第13頁(yè)/共33頁(yè)病毒分離材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種途徑接種后癥狀腦炎病毒蚊體懸液、尸解腦懸液小鼠腦內(nèi)、腹腔腦炎柯薩奇病毒A組咽拭子、糞便懸液、腦脊液、尸解腦懸液乳鼠（小于3d）皮下、腦內(nèi)、腹腔弛緩性麻痹柯薩奇病毒B組咽拭子、糞便懸液、腦脊液、尸解腦懸液乳鼠（小于24h）皮下、腦內(nèi)、腹腔震顫、痙攣性麻痹狂犬病病毒唾液、腦懸液小鼠腦內(nèi)腦炎

常用動(dòng)物接種分離的病毒及接種途徑

第14頁(yè)/共33頁(yè)小白鼠的腦內(nèi)接種1、取病毒懸液：用0.25ml注射器取0.1ml病毒懸液，去除注射器內(nèi)的氣泡。2、固定小白鼠：用左手大拇指和食指握住小白鼠的頭部，手掌輕輕按住小白鼠的體部。3、消毒注射部位：右手用棉簽蘸以碘酒，消毒小白鼠的右側(cè)顳部皮毛（不碰到眼）。第15頁(yè)/共33頁(yè)4、接種：右手拿注射器在小白鼠顳部（眼與耳根聯(lián)線的中點(diǎn)略偏耳朵的方向）注入，進(jìn)入顱腔即可，（一般進(jìn)針2－3mm）不要插得太深。5、觀察：注射完畢，將用過(guò)的注射器放入煮沸消毒器內(nèi)，煮沸消毒。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于防蚊設(shè)備的室內(nèi)飼養(yǎng)，逐日觀察動(dòng)物發(fā)病情況。第16頁(yè)/共33頁(yè)處死小白鼠-頸椎脫臼法第17頁(yè)/共33頁(yè)2.雞胚接種接種途徑可根據(jù)病毒種類(lèi)選擇適宜接種部位，如分離流感病毒常用羊水囊和尿囊同時(shí)接種法，而痘病毒常采用絨毛尿囊膜接種法

尿囊腔接種法卵黃囊接種法絨毛尿囊膜接種法羊膜囊接種法

第18頁(yè)/共33頁(yè)常用雞胚分離或鑒定的病毒

病毒

接種途徑

接種后變化

血清學(xué)診斷所用材料

痘苗病毒

絨毛尿囊膜

痘斑

產(chǎn)生痘斑的絨毛尿囊膜

單純皰疹病毒

絨毛尿囊膜

白斑、核內(nèi)包涵體

尿囊液

流感病毒

羊水囊、尿囊

產(chǎn)生血凝素

尿囊液

腮腺炎病毒

羊水囊或卵黃囊

產(chǎn)生血凝素

羊水

第19頁(yè)/共33頁(yè)判斷雞胚是否存活⑴在檢卵燈下觀察能否看到清晰的血管；⑵胚胎是否移動(dòng)；⑶若胚齡過(guò)長(zhǎng)，則需觀察其胎盤(pán)部分，胎盤(pán)部分變蒼白說(shuō)明胚胎死亡，正常時(shí)胎盤(pán)發(fā)暗，蛋白部分透亮。第20頁(yè)/共33頁(yè)判斷雞胚是否存活第21頁(yè)/共33頁(yè)氣室雞胚卵黃囊尿囊腔羊膜腔

絨毛尿囊膜卵白卵膜第22頁(yè)/共33頁(yè)雞胚結(jié)構(gòu)示意圖卵膜第23頁(yè)/共33頁(yè)絨毛尿囊膜接種法定位：將胎盤(pán)部分及自然氣室部分用記號(hào)筆畫(huà)出，在離開(kāi)胎盤(pán)與大血管區(qū)畫(huà)一直徑約1cm的等邊三角形卵窗第24頁(yè)/共33頁(yè)取卵殼：依次用碘酊，酒精消毒記號(hào)處，用鋸片將標(biāo)記三角區(qū)卵殼鋸穿，（注意勿損傷卵殼下各層膜組織），取下所畫(huà)三角形區(qū)域的卵殼，（注意卵殼下各層膜組織），然后用針尖輕輕將暴露的卵膜中心刺破一個(gè)小口（不要傷及絨毛尿囊膜）。造人工氣室：在自然氣室部分消毒后用錐子或大注射器針頭在氣室正中鉆一孔，用橡皮頭自氣室端小孔將氣室中空氣吸出，使絨毛尿囊膜下陷形成一“人工氣室”。第25頁(yè)/共33頁(yè)接種：去除卵膜，于絨毛尿囊膜上滴上病毒0.1~0.2ml。封口：用膠布封口，膠布事先用碘酒消毒，并通過(guò)火焰燒去余碘。培養(yǎng)：放入溫箱培育4天，然后收獲病毒。第26頁(yè)/共33頁(yè)二.真菌菌落的觀察（示教）真菌培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在一般培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)常用沙保弱（Sabouraud）培養(yǎng)基（含4%葡萄糖、10%蛋白胨、瓊脂、PH4.0~6.0），真菌的最適酸堿度是PH4.0~6.0，最適生長(zhǎng)溫度淺部真菌22~28℃深部真菌37℃。第27頁(yè)/共33頁(yè)真菌菌落類(lèi)型酵母型菌落（yeastcolony）

菌落光滑、濕潤(rùn)。無(wú)菌絲隱球菌菌落類(lèi)酵母型菌落（yeast-likecolony）

外觀和酵母型菌落相似，顯微鏡下可看到假菌絲白色念株菌菌落絲狀型菌落（filamentouscolony）菌落系由多細(xì)胞菌絲體所組成大多數(shù)絲狀真菌或霉菌的菌落第28頁(yè)/共33頁(yè)新型隱球菌：菌落屬酵母型菌落，圓形、較大、白色、邊緣整齊，表面濕潤(rùn)光滑，與一般細(xì)菌菌落相似。白色念珠菌：菌落屬類(lèi)酵母樣菌落，圓形、較大、白色、菌落底層有假菌絲長(zhǎng)入培養(yǎng)基內(nèi)。第29頁(yè)/共33頁(yè)表皮癬菌：菌落屬絲狀菌落，在沙保瓊脂斜面培養(yǎng)基上菌落開(kāi)始為白色，顆粒狀，以后變?yōu)榻q毛樣甚至粉末狀，有許多輻射狀溝，且培養(yǎng)基常有皺裂。小孢子菌：菌落屬絲狀菌落，在沙保培養(yǎng)基上菌落為棉絮狀、羊毛狀或粉末