微生物發(fā)酵技術(shù)

微生物發(fā)酵技術(shù)第1頁/共48頁項目2微生物發(fā)酵技術(shù)

任務(wù)4：發(fā)酵過程控制技術(shù)第2頁/共48頁教學(xué)安排：

1.員工培訓(xùn)由老師講解發(fā)酵過程的理論基礎(chǔ)。分配實操任務(wù)：發(fā)酵過程控制。

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2.學(xué)生模擬組建運營一個發(fā)酵車間，撰寫計劃書(在理論教學(xué)期間完成)。

市場部：當(dāng)前發(fā)酵過程控制的技術(shù)進展。技術(shù)部：確定pH、溫度、溶O2、補料等關(guān)鍵參數(shù)的控制方法，撰寫操作規(guī)程。品控部：制定發(fā)酵過程控制的方案?？偨?jīng)理：協(xié)調(diào)監(jiān)督各部工作，最后拿出完整的計劃書。第4頁/共48頁3.計劃書實施。計劃書要先經(jīng)過老師的審核，然后實施。實施過程中考核操作技能。實施后及時進行實訓(xùn)報告的撰寫也總結(jié)。第5頁/共48頁第一節(jié)微生物發(fā)酵類型一分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵與連續(xù)發(fā)酵二需氧發(fā)酵與厭氧發(fā)酵三生長偶聯(lián)型、部分生長偶聯(lián)型和非生長偶聯(lián)型第6頁/共48頁第二節(jié)發(fā)酵過程工藝參數(shù)控制一物理參數(shù)1溫度2壓力：內(nèi)部壓力高于外部壓力。3攪拌轉(zhuǎn)速：轉(zhuǎn)/分鐘4攪拌功率：每立方米發(fā)酵液所消耗的功率，kw/m35空氣流量：每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積，V/V.min6粘度：反映氧傳遞阻力和菌體濃度。第7頁/共48頁二化學(xué)參數(shù)1pH2基質(zhì)濃度：糖、氮、磷等。3溶解氧濃度4氧化還原電位5產(chǎn)物濃度6廢氣中氧的含量7廢氣中CO2的含量。三生物參數(shù)1菌體濃度2菌絲形態(tài)第8頁/共48頁第三節(jié)發(fā)酵過程中的代謝變化一初級代謝產(chǎn)物發(fā)酵的代謝變化1菌體濃度的變化延遲期、對數(shù)生長期、靜止期和死亡期。延遲期的長短與培養(yǎng)條件和菌種生理狀態(tài)有關(guān)。在未達死亡期之前放罐。第9頁/共48頁2營養(yǎng)基質(zhì)濃度的變化隨發(fā)酵時間的延長不斷降低，用于菌體的生長和產(chǎn)物的形成。溶氧的變化規(guī)律(后面講)。3產(chǎn)物濃度的變化

(1)與菌體濃度平行；

(2)與培養(yǎng)條件有關(guān)。第10頁/共48頁二次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵的代謝變化次級代謝發(fā)酵的菌體生長(生長期)和產(chǎn)物合成期(生產(chǎn)期)是分開的。發(fā)酵過程可分為：菌體生長、產(chǎn)物合成、菌體自溶三個階段。1菌體生長階段

(1)營養(yǎng)成分的變化碳源、氮源和磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，濃度明顯減少，而新菌體不斷合成，菌濃明顯增加。第11頁/共48頁(2)攝氧率的變化隨菌濃增加，攝氧率不斷增加，溶氧濃度下降，菌濃至臨界，溶氧至最低。(3)pH

先下降后下升：利用葡萄糖產(chǎn)生酸，而后再被利用。先上升后下降：利用氨基酸的碳骨架，剩下氨，而后氨又被利用。限制性因素的出現(xiàn)，使菌體由生長向生產(chǎn)轉(zhuǎn)化。第12頁/共48頁2產(chǎn)物合成階段產(chǎn)物產(chǎn)量不斷增多，起至達到最大值，生產(chǎn)速率也達最大，直至產(chǎn)物合成能力衰退。該階段要嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，對產(chǎn)物的合成最為關(guān)鍵。例如營養(yǎng)濃度。3菌體自溶階段菌體衰老、開始自溶，氨氮含量升高，pH上升，產(chǎn)物合成能力衰退，生產(chǎn)速率下降。此時結(jié)束發(fā)酵。第13頁/共48頁第四節(jié)菌體濃度影響及其控制菌體濃度：單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。一影響菌體生長的因素1比生長速率：越大，菌體生長越快；決定于細(xì)胞的復(fù)雜性(越復(fù)雜越慢)；2營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件：營養(yǎng)物質(zhì)濃度在一定限度內(nèi)，濃度與菌體生長成正比。第14頁/共48頁

其它環(huán)境條件越適合，生長越快。二菌濃對初級代謝和次級代謝的影響

產(chǎn)物的產(chǎn)率：

Rp=Qp

·X

其中：Qp為比生產(chǎn)速率；

X為菌體濃度。

X太大的負(fù)面影響：

1營養(yǎng)物質(zhì)消耗太快；

2生產(chǎn)毒素；

3溶氧供應(yīng)不上。第15頁/共48頁發(fā)酵過程中菌濃度的控制通過調(diào)節(jié)生長速率實現(xiàn)，而這又要通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的營養(yǎng)基質(zhì)濃度。

第16頁/共48頁第五節(jié)營養(yǎng)基質(zhì)影響及其控制一碳源的影響及其控制1碳源的種類影響代謝情況迅速利用的碳源：迅速參與代謝，合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解產(chǎn)物，因此有利于菌體生長，但對產(chǎn)物(特別是次級代謝)有抑制作用(例如葡萄糖)。緩慢利用的碳源：可被菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、飴糖等)。第17頁/共48頁機理解釋：乳糖的利用速度剛好符合青霉素的合成速度。控制方法：流加葡萄糖或采用混合碳源。2碳源濃度的影響

濃度合適?？刂品椒ǎ褐虚g補料。第18頁/共48頁二氮源的影響和控制1氮源濃度的影響以谷氨酸發(fā)酵為例：NH4+太高：合成谷氨酰氨；NH4+不足：積累-酮戊二酸。2氮源的種類的影響速效氮源：氨基態(tài)氮和玉米漿，促進菌體生長，但對部分產(chǎn)物，特別是次級產(chǎn)物合成有抑制作用。緩慢氮源：延長產(chǎn)物合成期。第19頁/共48頁發(fā)酵培養(yǎng)基一般采用速效與緩慢氮源的混合物，且中間還要補充。(1)補加有機氮源(2)補加無機氮源(補氮和調(diào)pH雙重功效)。三磷酸鹽的影響和控制適合微生物生長的磷鹽濃度偏高；適合微生物藥物合成的磷鹽濃度偏低。發(fā)酵過程一般采用亞適量。第20頁/共48頁第六節(jié)溫度的影響及其控制一溫度對發(fā)酵的影響1影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)；菌體生長所需溫度與產(chǎn)物合成溫度不一致(如青霉素)；溫度不同還可能影響產(chǎn)物合成的方向(如金霉素和四環(huán)素)。2影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。(粘度、氧和基質(zhì)的溶解與傳遞、分解和吸收)第21頁/共48頁二影響發(fā)酵溫度變化的因素產(chǎn)熱的因素：1生物熱(Q生物)

與培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)階段有關(guān)。2攪拌熱(Q攪拌)散熱的因素：1蒸發(fā)熱(Q蒸發(fā))2輻射熱(Q輻射)第22頁/共48頁三溫度的控制1最適溫度的選擇2溫度的控制第23頁/共48頁第七節(jié)pH的影響及其控制一pH對發(fā)酵的影響1影響微生物的生長及產(chǎn)物的合成(通過影響酶活性實現(xiàn))；生長最適pH與合成最適pH不一致菌體內(nèi)的pH近中性，因為發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH是通過間接方式作用與胞內(nèi)酶的第24頁/共48頁2影響菌體對基質(zhì)的利用速度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)(通過影響膜實現(xiàn))；例如產(chǎn)黃青霉在低pH下為絲狀，高pH為酵母狀3影響產(chǎn)物的穩(wěn)定性；噻吶霉素在pH6.7-7.5時穩(wěn)定；青霉素在堿性條件下發(fā)酵產(chǎn)量低第25頁/共48頁二發(fā)酵pH的變化(影響因素)1菌種的遺傳特性菌種具有自我調(diào)節(jié)pH能力，但能力有限度(地中?？ㄖZ氏菌發(fā)酵生產(chǎn)利福霉素SV)2營養(yǎng)成分的分解代謝碳源分解代謝產(chǎn)生中間產(chǎn)物丙酮酸，產(chǎn)生丙酮酸的多少與碳源種類和濃度有關(guān)。

pH變化是菌體產(chǎn)酸或產(chǎn)堿的綜合作用結(jié)果，可能通過pH變化反應(yīng)發(fā)酵情況。第26頁/共48頁發(fā)酵pH的確定和控制1發(fā)酵pH的確定根據(jù)實驗結(jié)果確定2pH控制最適pH在微生物生長和產(chǎn)物形成相互關(guān)系：

(1)二者的pH相似且在較寬的內(nèi)；

(2)生長的pH較寬，而合成的pH較窄；

(3)二者都敏感，但最適點相同；

(4)二者都敏感，但最適點不同。第27頁/共48頁pH的控制方法：1培養(yǎng)基配比適當(dāng)，使pH在合適的范圍內(nèi)變化；2直接補加酸堿或補料；其中采用補料的方法可以同時實現(xiàn)補充營養(yǎng)、延長發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH和改變培養(yǎng)基性質(zhì)等幾種目的。第28頁/共48頁第八節(jié)溶氧的影響及控制一溶氧對發(fā)酵的影響影響菌體生長、產(chǎn)物合成及產(chǎn)物的性質(zhì)。1有時，氧充分促進產(chǎn)物合成，如谷氨酸和金霉素發(fā)酵；2有時，氧充足會對產(chǎn)物有抑制作用，如維生素B12發(fā)酵。

因此溶氧并非越高越好。第29頁/共48頁氨基酸發(fā)酵對氧的需求分三類：1谷氨酸、精氨酸和脯氨酸，氧必須供應(yīng)充足，產(chǎn)量才大；2異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸，供氧充分可獲得最高產(chǎn)量，但供氧受限時，不會有太大影響；3亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，供氧受限對產(chǎn)物合成有利。第30頁/共48頁二發(fā)酵過程的溶氧變化在一定的發(fā)酵條件下，每種產(chǎn)物發(fā)酵的溶氧變化都有自身的規(guī)律?？偟囊?guī)律：先下降，后上升，不同產(chǎn)物后期出現(xiàn)最低谷的時間不同。溶氧異常下降的原因：1污染好氣性雜菌；2菌體代謝異常；3某些設(shè)備或工藝控制發(fā)生故障，如攪拌。第31頁/共48頁引起溶氧異常升高的原因：1代謝異常，菌體過早衰老；2污染噬菌體。三溶氧濃度的控制溶氧濃度是由氧的供需平衡所決定的。供大于需時，溶氧上升；供小于需時，溶氧下降。提高供氧的方法：提高氧傳遞動力和液相體積氧傳遞系數(shù)。第32頁/共48頁氧傳遞動力的提高受限，只能通過攪拌、通氣及發(fā)酵液粘度控制?？刂菩柩醯姆椒ǎ盒柩趿渴芫w濃度、營養(yǎng)基質(zhì)的種類和濃度、培養(yǎng)條件影響，其中重要的是菌體濃度。菌體濃度可通過控制比生長速率來實現(xiàn)，這又要通過營養(yǎng)基質(zhì)濃度的控制來實現(xiàn)。第33頁/共48頁一二氧化碳對發(fā)酵的影響二氧化碳的作用：1刺激作用，如環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)芽孢子開始生長時就需要二氧化碳，此謂二氧化碳效應(yīng)。2抑制作用，影響生長速度、菌體形態(tài)、產(chǎn)物合成和培養(yǎng)基pH。第九節(jié)二氧化碳影響及其控制第34頁/共48頁二二氧化碳濃度的控制二氧化碳受呼吸強度、發(fā)酵液流變學(xué)特性、通氣攪拌程度和外界壓力大小影響。通過通氣和攪拌來控制。第35頁/共48頁第十節(jié)補料分批發(fā)酵一補料分批發(fā)酵的作用補料分批發(fā)酵的概念。補料分批發(fā)酵的優(yōu)點：(1)解除了底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解產(chǎn)物阻遏；(2)避免在分批發(fā)酵中因一次投料過多造成細(xì)胞大量生長所引起的不良影響，降低發(fā)酵液的粘度；第36頁/共48頁(3)可用作控制細(xì)胞質(zhì)量的手段，以提高發(fā)芽孢子的比例；(4)一種理論研究方法。(一)可以控制抑制性底物的濃度高密度的生物量需要投入幾倍的基質(zhì)，但高濃度的基質(zhì)有抑制作用。抑制原因：有的基質(zhì)濃度過濃使?jié)B透壓過高，細(xì)胞因脫水而死亡；(2)高濃度基質(zhì)能使微生物熱致死；(3)對代謝關(guān)鍵酶或細(xì)胞組分產(chǎn)生抑制作用；第37頁/共48頁(4)改變菌體的生化代謝而影響生長。部分前體物有毒性，部分是由于溶解度小。(二)可以解除或減弱分解產(chǎn)物阻遏部分合成酶受到易利用的碳或氮源的阻遏，例如葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物引起的阻遏。(三)可以使發(fā)酵過程最佳化第38頁/共48頁二補料的方式和控制(一)補料方式連續(xù)流加、不連續(xù)流加(多周期流加)。(二)補料控制

1有反饋控制反饋控制系統(tǒng)：傳感器、控制器和驅(qū)動器。

直接方法：以限制性營養(yǎng)物濃度作為反饋參數(shù)；

間接方法：以溶氧、pH、呼吸商、排氣中的CO2及代謝產(chǎn)物濃度等為參數(shù)。第39頁/共48頁

間接方法的例子：以CO2和pH為控制參數(shù)。2無反饋控制經(jīng)驗補料法。第40頁/共48頁第十一節(jié)泡沫的影響及控制

泡沫(機械泡沫和流態(tài)泡沫)的危害：1