原生質(zhì)體的培養(yǎng)與融合

原生質(zhì)體的培養(yǎng)與融合第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合本章主要內(nèi)容第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四原生質(zhì)體（Protoplast）含義：去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細(xì)胞。第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四微絲葉綠體線粒體質(zhì)膜細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微管細(xì)胞壁高爾基體植物細(xì)胞模式圖液泡第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)

原生質(zhì)體分離及純化一、原生質(zhì)體分離雙子葉外植體胚性細(xì)胞第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料-----葉肉細(xì)胞。（一）材料來源禾本科植物：愈傷組織或懸浮細(xì)胞。第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四（二）分離方法機(jī)械分離法酶法分離法第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四1、機(jī)械分離法（Machanicalisolation）優(yōu)點：

（1）能排除酶的有害影響；

缺點：

（1）原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；

（2）方法繁瑣費(fèi)力；

（3）局限性大第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四（1）酶的種類纖維素酶類（Cellulase）果膠酶類（Pectolyase）半纖維素酶類（Hemicellulase）崩潰酶蝸牛酶2、酶法分離（Enzymaticisolation）第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四（2）酶液的配制滲透壓穩(wěn)定劑及pH酶的配比及濃度果膠酶：濃度不宜超過2%,纖維素酶(1-2%)滲透壓穩(wěn)定劑:（500－600mmol/L甘露醇)第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四（3）分離原生質(zhì)體兩步分離法一步分離法方法有二：葉肉原生質(zhì)體分離提純第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）過濾、離心加果膠酶和纖維素酶第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四葉片愈傷組織第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四二、原生質(zhì)體純化與活力測定（一）原生質(zhì)體純化方法三種離心沉淀法漂浮法界面法第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四1、離心沉淀法原理：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：第一步原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過濾。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此2-3次。第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四2、漂浮法原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網(wǎng)篩過濾。第二步：濾液和高滲溶液混合，離心。第三步：小心吸取上層原生質(zhì)體，洗滌液重復(fù)洗2-3次。第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1次。第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四

3、界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四（二）原生質(zhì)體活力測定1、形態(tài)識別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。2、染色識別1）0.1%酚番紅染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）0.025%Evans藍(lán)染色：有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取

2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)一、培養(yǎng)基pH滲透壓鈣源生長物質(zhì)氮源碳源培養(yǎng)基第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四二、培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四肉眼可見細(xì)胞團(tuán)愈傷組織器官發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑植株植株再生途徑第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四定義：原生質(zhì)體融合也叫做體細(xì)胞雜交，使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。第三節(jié)原生質(zhì)體融合第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四原生質(zhì)體融合第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四一、原生質(zhì)體融合意義—克服雜交不親合—克服生殖器官敗育—克服多胚現(xiàn)象第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四番茄+馬鈴薯第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四二、融合方法無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合高pH-高Ca離子聚乙二醇(PEG)法

PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法電融合技術(shù)第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四(一)無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合:NaNO3法1972年：Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高。第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四

1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃時，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。優(yōu)點：雜種產(chǎn)量高。不足：高pH值對細(xì)胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca離子法第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四PEG法特點：融合頻率高可重復(fù)性強(qiáng)誘發(fā)融合無特異性毒性較低植物+植物植物+動物動物+酵母PolyethyleneGlycol（聚乙二醇）（三）PEG法第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四PEG法原理PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四PEG法示意圖-+-橋梁+-PEG被洗掉+-+-電荷重排+-+-+-+-膜接觸第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四最為常用。具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體----滴加PEG溶液，搖勻，靜置---滴加高鈣-高pH溶液，搖勻，靜置---滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次---離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)---篩選---再生雜合細(xì)胞（四）PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四(五)電融合技術(shù)Senda首先用此方法實現(xiàn)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合儀第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四電融合法原理交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠。+-負(fù)極正極+-+-+-+-+-+-+-+-第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四原生質(zhì)體的融合過程：第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四三、體細(xì)胞雜種細(xì)胞篩選與鑒定1．互補(bǔ)選擇法2、機(jī)械分離雜種細(xì)胞法3.雙熒光標(biāo)記選擇法第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色3.雙熒光標(biāo)記選擇法第41頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第42頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四四、體細(xì)胞雜種植株的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)觀察

DNA多態(tài)性分析同工酶分