臨床微生物檢查課件 第26章-肝炎病毒-11檢本

1肝炎病毒是引起病毒性肝炎的病原體，目前公認(rèn)的人類(lèi)肝炎病毒至少有5種型別：甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒。甲型和戊型肝炎病毒：消化道傳播，引起急性肝炎，不轉(zhuǎn)為慢性肝炎或慢性攜帶者。2乙型和丙型肝炎病毒均由輸血、血制品或注射器污染而傳播，除引起急性肝炎外，可致慢性肝炎，并與肝硬化及肝癌相關(guān)。丁型肝炎病毒為一種缺陷病毒，必須在乙型肝炎病毒等輔助下方能復(fù)制，故其傳播途徑與乙型肝炎病毒相似。與人類(lèi)肝炎相關(guān)的病毒：己型(HFV)、庚型(HGV)、TT型肝炎病毒(TTV)等巨細(xì)胞病毒、EB病毒、黃熱病病毒等也可引起肝炎。3名稱縮寫(xiě)傳播途徑所致疾病甲型肝炎病毒HAV糞-口甲型肝炎乙型肝炎病毒HBV血，母嬰垂直乙型肝炎丙型肝炎病毒HCV血丙型肝炎丁型肝炎病毒HDV血(與HBV同時(shí))丁型肝炎戊型肝炎病毒HEV糞-口戊型肝炎己型肝炎病毒HFV糞-口己型肝炎庚型肝炎病毒HGV血庚型肝炎TT型肝炎病毒TTV糞-口，血非甲-庚型肝炎幾種肝炎病毒主要區(qū)別4科屬HAV小RNA病毒科肝病毒屬HBV肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬HCV黃病毒科丙型肝炎病毒屬HDV沙粒病毒科δ病毒屬HEV(杯狀病毒科)野田村病毒科戊型肝炎病毒屬HFV？？HGV？？TTV？？5甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus，HAV)屬于小RNA病毒科，肝病毒屬(hepatovirus)(腸道病毒72型)一、生物學(xué)性狀1、形態(tài)與結(jié)構(gòu)球形、無(wú)包膜、直徑27nm。核心：?jiǎn)握蒖NA。電鏡下可見(jiàn)實(shí)心及空心兩種顆粒。6HAV的電鏡照片7HAV的結(jié)構(gòu)8HAV基因組為RNA。按其功能可分為3個(gè)部分：5’端非編碼區(qū)(5’non-codingregion,5’NCR)：雖不編碼蛋白質(zhì)，但因其序列較保守，可用于制作探針，進(jìn)行核酸雜交快速診斷HAV感染。P1～P3區(qū)：編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1,VP2,VP3,VP4)、非結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白。3’端非編碼區(qū)：功能尚不清楚。9P3polyAP23’端非編碼區(qū):功能尚不清楚P15’NCR：其序列較保守，可用于制作探針.

P1～P3區(qū)：編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1,VP2,VP3,VP4)、非結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白.10HAV復(fù)制HAV吸附易感細(xì)胞穿入和脫殼同步完成？吞入以后,再進(jìn)行脫殼＋ssRAN釋放作為mRNA翻譯出子代病毒蛋白復(fù)制出子代病毒RAN生物合成組裝成子代病毒體112、血清型只有一個(gè)血清型。共分7個(gè)基因型，Ⅰ～Ⅶ型，HAV的基因型有種屬特異性，感染人類(lèi)的HAV屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ，某些型還可分亞型如ⅠA、ⅠB等。123、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與培養(yǎng)易感動(dòng)物較多：黑猩猩、狨猴、狒狒、獼猴、恒河猴等。主要用途在于研究發(fā)病、免疫機(jī)制及對(duì)減毒活疫苗的毒力和免疫效果考核。細(xì)胞培養(yǎng)：狨猴原代肝細(xì)胞、恒河猴胚腎傳代細(xì)胞株、人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞等。13HAV增殖非常緩慢，自標(biāo)本中分離HAV常需要數(shù)周至數(shù)月，并很難獲得大量病毒?？捎妹庖邿晒馊旧ǎ瑱z出細(xì)胞培養(yǎng)中的HAV。也可將培養(yǎng)細(xì)胞裂解后，用放射免疫法檢測(cè)。144、抵抗力HAV比腸道病毒更耐熱、耐氯化物的消毒作用,故可在污染的廢水、海水及食品中存活數(shù)月或更久。耐酸、耐乙醚及氯仿。98～100℃,5min,可滅活。高壓滅菌、紫外線、甲醛、高錳酸鉀、均可有效滅活HAV。15二、臨床意義傳染源:患者(潛伏期15～50天,平均30天)傳播途徑：糞-口病毒常在轉(zhuǎn)氨酶升高前5～6天就存在于患者的血液和糞便中，HAV隨糞便排出體外，通過(guò)污染水源、食物、海產(chǎn)品(毛蚶等)、食具等傳播而造成散發(fā)流行或大流行。16糞-口途徑傳播口咽部或唾液腺中早期增殖腸道與局部淋巴結(jié)中大量增殖入血并形成病毒血癥肝臟(病毒直接損傷或免疫病理作用)通過(guò)膽汁隨糞便排出體外HAV的致病性17甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus,HAV)

18HAV的免疫性HAV只存在單一的抗原抗體系統(tǒng)，即HAV-Ag和抗-HAV。2周，腸道中抗-HAVIgA及血清中抗-HAVIgM/IgG的產(chǎn)生，糞便中不再排出病毒。抗-HAV的IgM(甲肝的確診依據(jù))和IgG(可維持多年，對(duì)病毒的再感染有免疫力)。預(yù)后較好。19三、微生物學(xué)檢查1、標(biāo)本的采集、處理與保存：血清學(xué)診斷急性期和恢復(fù)期血清(4℃可存放3周以上)糞便發(fā)病前2周內(nèi)或出現(xiàn)癥狀后幾天中。用含0.02%疊氮鈉PBS配制成20%的糞便勻漿，存放4℃或-20℃～-70℃。202、檢測(cè)抗原：免疫電鏡(IEM)、固相IEMELISA/EIA3、檢測(cè)核酸：核酸雜交PCR213、抗體檢測(cè)：抗-HAVIgM和抗-HAV總抗體ELISA或RIA(新近感染的重要指標(biāo))抗-HAVIgG或抗-HAV總抗體中和試驗(yàn)、EIA試驗(yàn)等。急性期和恢復(fù)期雙份血清，效價(jià)升高≥4倍，近期HAV感染。無(wú)4倍增高，為既往感染。2223乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)是乙型肝炎的病原體。嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。僅能在人和少數(shù)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中復(fù)制，黑猩猩是對(duì)HBV最敏感的動(dòng)物。24HBV尚不能在細(xì)胞培養(yǎng)中分離及培養(yǎng)，目前采用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是病毒DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，主要用于過(guò)篩抗HBV藥物。用S基因轉(zhuǎn)染一些細(xì)胞系，如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)，可以分泌HBsAg而不含病毒其他蛋白，已用于制備疫苗。鴨乙肝病毒感染的動(dòng)物模型：用于過(guò)篩抗病毒藥物及研究消除免疫耐受機(jī)制。25(1)形態(tài)結(jié)構(gòu)：1.大球形顆粒：又叫Dane顆粒完整的，具有感染性的HBV，具有HBV的典型形態(tài)、結(jié)構(gòu)，球形，雙層衣殼，直徑42nm，叫Dane顆粒。

一、生物學(xué)性狀261)外衣殼(包膜)：脂質(zhì)雙層＋蛋白質(zhì)HBsAg、PreS1、PreS22)內(nèi)衣殼：直徑27nmHBcAg、HBeAg3)核心：雙股環(huán)狀DNA、DNA多聚酶肝細(xì)胞核內(nèi)合成HBcAg。肝細(xì)胞漿內(nèi)合成HBsAg，并組裝成Dane顆粒2728292.小球形顆粒:無(wú)核酸，直徑22nm。含HBsAg(過(guò)剩的衣殼)3.管形顆粒:小球形顆粒連接而成。22nm×100～500nm,HBsAg;30(2)基因結(jié)構(gòu)：為雙鏈環(huán)狀DNA，由長(zhǎng)、短兩鏈組成。長(zhǎng)鏈為負(fù)鏈，具有固定的長(zhǎng)度。短鏈為正鏈，則有可變的長(zhǎng)度，約為長(zhǎng)鏈的50%～80%。長(zhǎng)鏈DNA含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架(Openreadingframe,ORF)，分別稱為S、C、P、X區(qū)。312.HBV基因組結(jié)構(gòu)pre-S1→pre-S1蛋白pre-S2→pre-S2蛋白S→HBsAgpre-C→HBeAgC→HBcAgP→DNAPX→HBxAgHBsAgpre-S2pre-S132(3)抗原成分：1.HBsAgHBsAg是決定病毒吸附至易感細(xì)胞受體的成分，是HBV感染的主要指標(biāo)。HBsAg具有抗原性，可引起機(jī)體產(chǎn)生特異性的保護(hù)性抗體抗-HBs，也是制備疫苗的最主要成分?？?HBs出現(xiàn)表示病毒基本清除，是乙肝痊愈的臨床標(biāo)志。33HBsAg(＋)：乙肝患者。無(wú)癥狀攜帶者。HBsAg(＋)＜6m：急性乙肝HBsAg(＋)＞6m：慢性乙肝供血員必須HBsAg(－)34抗-HBs：IgG是中和抗體，可清除細(xì)胞外的HBV；與HBV表面結(jié)合，使HBV失去感染性。血清抗-HBs(＋)對(duì)HBV有免疫力：感染或預(yù)防接種血清不具有傳染性；轉(zhuǎn)歸為痊愈，預(yù)后良好352.HBcAg存在于Dane顆粒核心部位的表面，為內(nèi)衣殼成分。其外被HBsAg所覆蓋，故不易在血循環(huán)中檢出。其抗原性強(qiáng)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBc。抗-HBcIgG在血中持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，為非保護(hù)性抗體?？?HBcIgM的存在常提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)。3637抗-HBc：非中和抗體(先IgM，后IgG)；抗-HBcIgM(＋)：HBV復(fù)制；抗-HBcIgM(－)：非急性乙肝；供血員需抗-HBcIgM(－)383.HBeAg為可溶性蛋白質(zhì)，其消長(zhǎng)與病毒體及DNA多聚酶的消長(zhǎng)基本一致，故可作為HBV復(fù)制及具有強(qiáng)感染性的一個(gè)指標(biāo)。血HBeAg(＋)：體內(nèi)有HBV復(fù)制，血清有強(qiáng)傳染性；＞6m，急性轉(zhuǎn)為慢性；(＋)→(－)恢復(fù)，預(yù)后良好;可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBe。39抗體（抗-HBe）：中和抗體；有一定保護(hù)作用；抗-HBe的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象;但PreC突變株感染者雖抗-HBe＋，其體內(nèi)仍有HBV復(fù)制，血清仍有傳染性(檢測(cè)HBV-DNA)404.PreS抗原(PreS1、PreS2)存在于外衣殼PreS1及PreS2抗原可吸附于肝細(xì)胞受體的表位，其抗原性比HBsAg更強(qiáng)。抗-PreS2及抗-PreS1能通過(guò)阻斷HBV與肝細(xì)胞結(jié)合而起抗病毒作用?？?PreS2的出現(xiàn)表示病情好轉(zhuǎn)，為預(yù)后良好征兆。41HBV與表面受體結(jié)合胞飲脫衣殼DNA入細(xì)胞核3.5kb的mRNA轉(zhuǎn)錄核心蛋白、多聚酶和X蛋白翻譯2.1kb的mRNA外衣殼蛋白R(shí)NA裝配入內(nèi)衣殼RNA逆轉(zhuǎn)錄為病毒DNA核心被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹,然后胞吐出細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)修復(fù)翻譯4344(4)抵抗力較強(qiáng)，對(duì)低溫、干燥、紫外線均有耐受性;不被70%乙醇滅活。敏感：高壓蒸汽滅菌法；100℃，10min；0.5%過(guò)氧乙酸；3%漂白粉；5%次氯酸鈉；環(huán)氧乙烷；失去傳染性，但仍可保留抗原性.45二、臨床意義：致病性與免疫性1.傳染源；乙肝患者(潛伏期30~160天，急性期及慢性活動(dòng)期)；HBsAg攜帶者(約10%，人群感染率60%)2.傳染途徑：血液、血制品等母嬰垂直傳播接觸傳播:性接觸,密切接觸等463.所致疾病：乙型肝炎HBsAg攜帶者急性乙肝慢性乙肝重癥乙肝474.致病機(jī)理：非病毒直接對(duì)肝細(xì)胞的損害；免疫病理?yè)p害：病毒變異逃逸免疫機(jī)制；機(jī)體免疫應(yīng)答低下干擾素少；肝細(xì)胞上MHC-Ⅰ類(lèi)分子低；IL-2少；病毒的持續(xù)性存在48細(xì)胞免疫導(dǎo)致的免疫病理?yè)p害CTL既清除HBV，又損傷表達(dá)HBV抗原的肝細(xì)胞。Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)；免疫復(fù)合物導(dǎo)致的病理?yè)p害Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)；自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的病理?yè)p害自身抗原：肝特異性脂蛋白抗原LSP→Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)495051525.免疫性：既有保護(hù)作用又有病理?yè)p害⑴.抗體：抗-HBs：中和抗體抗-PreS1及抗-PreS2：阻斷HBV吸附于肝細(xì)胞抗-HBe和抗-HBc無(wú)保護(hù)作用⑵.細(xì)胞免疫：HBcAg特異性CTL清除肝細(xì)胞內(nèi)的HBV；并損害表達(dá)HBV抗原的肝細(xì)胞；536.HBV與原發(fā)性肝癌：流行病學(xué)：乙肝患者易發(fā)生原發(fā)性肝癌.血清學(xué)：原發(fā)性肝癌患者血清中HBV陽(yáng)性率比自然人群的高；核酸雜交：HBV的DNA(X基因)整合于肝細(xì)胞DNA上，反式激活細(xì)胞癌基因；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：土撥鼠感染病毒，100%誘生原發(fā)性肝癌；545556三、微生物學(xué)檢查1、標(biāo)本采集與處理血清學(xué)檢查：血液核酸分析的標(biāo)本：血清或血漿(肝素抗凝血漿不宜作PCR)免疫熒光、原位雜交、免疫組化等以檢測(cè)HBV相關(guān)抗原或顆粒：肝組織活檢標(biāo)本。572、檢查方法與結(jié)果分析主要用血清學(xué)方法檢測(cè)HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe及抗-HBc(二對(duì)半)。以RIA和ELISA最敏感血清HBVDNA檢測(cè)：核酸雜交法、PCR。以進(jìn)行疾病診斷和藥物療效的考核指標(biāo)。血清DNA多聚酶檢測(cè)：可判斷體內(nèi)是否有病毒正在進(jìn)行復(fù)制。58HBV抗原抗體檢測(cè)結(jié)果的臨床意義HBsAgHBeAg抗-HBs抗-HBe抗-HBc意義＋－－－－HBsAg攜帶者＋＋－－－急/慢性乙肝/攜帶者＋＋－－＋急/慢性乙肝＋－－＋＋急性感染趨向恢復(fù)－－＋＋＋/－乙肝恢復(fù)期＋＋－既往感染恢復(fù)期－－－－＋感染過(guò)HBV－－＋－－感染過(guò)/接種過(guò)有傳染性有傳染性有V復(fù)制痊愈？V復(fù)制59“兩對(duì)半”分析舉例HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋

＋＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋＋＋大三陽(yáng)小三陽(yáng)60HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋急性肝炎早期，傳染性強(qiáng)61HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋急性或慢性現(xiàn)癥感染，傳染性強(qiáng)?！按笕?yáng)”62HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋有無(wú)傳染性應(yīng)結(jié)合HBVDNA檢測(cè)結(jié)果“小三陽(yáng)”63HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋＋＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋＋＋有過(guò)HBV感染，目前有無(wú)傳染性應(yīng)結(jié)合HBVDAN結(jié)果64HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋HBV感染的恢復(fù)期，有免疫力，無(wú)傳染性65HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

＋＋＋①注射疫苗后；②遙遠(yuǎn)的過(guò)去有過(guò)HBV感染66HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

＋＋①窗口期，抗-HBs即將出現(xiàn)；②HBV感染已過(guò)672.血清HBVDNA檢測(cè)3.血清HBVDNA多聚酶檢測(cè)了解有無(wú)HBV復(fù)制6869⑴診斷⑵判斷血有傳染性：HBsAg(＋)，抗HBc(＋)，及HBeAg(＋)；⑶預(yù)后：HBsAg(＋),HBeAg(＋),抗HBc(＋),＞6m,表示急性轉(zhuǎn)為慢性⑷篩選供血員：兩對(duì)半全(－)；至少HBsAg(－)，抗HBc(－).⑸流調(diào)：發(fā)現(xiàn)HBsAg(＋)的無(wú)癥狀攜帶者⑹觀察疫苗效果：僅抗-HBs＋；70防治：

1.切斷傳播途徑：嚴(yán)格篩選供血員；嚴(yán)格檢查血制品；嚴(yán)格滅菌有HBV污染的醫(yī)療用品；預(yù)防注射（人工主動(dòng)免疫）：乙肝疫苗→新生兒，高危人群；2.緊急預(yù)防（人工被動(dòng)免疫）：高效價(jià)抗-HBs（HBIG）3.治療：護(hù)肝，對(duì)癥；71丙型肝炎病毒(HCV)一.生物學(xué)性狀：(一)形態(tài)結(jié)構(gòu):⑴

單正股的RNA病毒.⑵球形.⑶有包膜,對(duì)有機(jī)溶劑敏感.至今,未確切觀察到HCV病毒顆粒,所有相關(guān)研究來(lái)源于對(duì)與HCV基本相似的HCV病毒樣顆粒(Virus-likeparticles,VLPs),稱為HCVVLPs.7273(二)基因結(jié)構(gòu):1.5’端非編碼區(qū):序列較保守,可作為核酸診斷的標(biāo)志物(如PCR).2.核心蛋白區(qū):編碼核心蛋白核心蛋白組成衣殼蛋白.與肝細(xì)胞癌變有關(guān).3.包膜蛋白區(qū):編碼包膜蛋白E1和E2E區(qū)的變異較大,引起病毒表面抗原易變異.導(dǎo)致慢性病程.744.非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū):編碼絲氨酸蛋白激酶、解旋酶、RNA依賴性的RNA多聚酶等.5.3’端非編碼區(qū):

穩(wěn)定RNA結(jié)構(gòu).

與翻譯有關(guān).75(3)復(fù)制HCV進(jìn)入細(xì)胞＋ssRNA釋放－RNA＋RNA翻譯出蛋白質(zhì)拼接為子代RNA子代病毒體76(四)變異HCV的RNA變異比真核細(xì)胞高106倍.HCV的準(zhǔn)種(quasispecies):準(zhǔn)種是由于依賴RNA的RNA多聚酶缺乏校正功能,導(dǎo)致RNA基因