細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生與檢測方法

主要內(nèi)容細(xì)菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細(xì)菌耐藥產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的檢測第一頁，共63頁。第二頁，共63頁。細(xì)菌定義廣義定義：是指一大類細(xì)胞核無核膜包裹，只存在裸露DNA的原始單細(xì)胞生物，包括真細(xì)菌和古生菌兩大類群。細(xì)菌數(shù)量：所有生物中數(shù)量最多的一類。細(xì)菌廣泛存在我們?nèi)祟愺w內(nèi)，人體內(nèi)及表皮上的細(xì)菌總數(shù)約是人體細(xì)胞總數(shù)的十倍。第三頁，共63頁。細(xì)菌與人類關(guān)系第四頁，共63頁。細(xì)菌結(jié)構(gòu)第五頁，共63頁。細(xì)菌致病性細(xì)菌在人體內(nèi)寄生，增殖并引起疾病的特性稱為細(xì)菌的致病性第六頁，共63頁。侵襲力胞外酶血漿凝固酶游離血漿凝固酶凝聚因子鏈激酶:激活纖溶酶原或胞漿素原,破壞纖維蛋白屏障透明質(zhì)酸酶：溶解結(jié)締組織透明質(zhì)酸莢膜:抵抗吞噬其他表面活性物質(zhì):Vi抗原、K抗原等第七頁，共63頁。毒素外毒素主要由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生親組織性，選擇性地作用于某些組織和器官。破傷風(fēng)桿菌毒素麻痹運動神經(jīng)肉毒桿菌毒素造成眼及咽肌的麻痹白喉桿菌引起心肌炎、腎上腺出血及神經(jīng)麻痹等。內(nèi)毒素主要由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生無組織選擇性，引起的病理變化和臨床癥狀大致相同發(fā)熱反應(yīng)糖代謝紊亂影響血管舒縮機能彌漫性血管內(nèi)凝血第八頁，共63頁。細(xì)菌侵入途徑、數(shù)量與感染多數(shù)病原菌只有經(jīng)過特定的門戶侵入，并在特定部位定居繁殖，才能造成感染。痢疾桿菌必須經(jīng)口侵入，定居于結(jié)腸內(nèi)，才能引起疾病。破傷風(fēng)桿菌，只有經(jīng)傷口侵入，厭氧條件下，引發(fā)疾病。病原菌的數(shù)量與致病能力一般成正比。第九頁，共63頁。主要內(nèi)容細(xì)菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細(xì)菌耐藥產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的檢測第十頁，共63頁?？咕幬锂a(chǎn)生第十一頁，共63頁?？咕幬锏亩x

抗菌藥物包括：抗生素由微生物（如細(xì)菌、真菌、放線菌）、植物和動物在其生命活動過程中所產(chǎn)生人工半合成、全合成的化學(xué)藥物第十二頁，共63頁?？咕钚愿鶕?jù)不同特性分為：抑菌劑：速效抑菌劑（四環(huán)素類、林可霉素類、氯霉素與大環(huán)內(nèi)酯類）和慢效抑菌劑（磺胺類）殺菌劑：繁殖期殺菌劑（青霉菌素類及頭孢菌素類）和靜止期殺菌劑（喹諾酮類、氨基糖苷類、多粘菌素類）活性評價指標(biāo)最低抑菌濃度（MIC）指能夠抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長的最低濃度最低殺菌濃度(MBC）指能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長的最低濃度第十三頁，共63頁?？咕幬锓诸?1)β-內(nèi)酰胺類：青霉素類和頭孢菌素類的分子結(jié)構(gòu)中含有β-

內(nèi)酰胺環(huán)。(2)氨基糖苷類：包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素等。(3)四環(huán)素類：包括四環(huán)素、土霉素、金霉素及強力霉素等。(4)氯霉素類：包括氯霉素、甲砜霉素等。(5)大環(huán)內(nèi)脂類：紅霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素、阿奇霉素等。(6)糖肽類抗生素：萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧。(7)喹諾酮類：諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、加替沙星等。第十四頁，共63頁?？咕幬锓诸?/p>

(8)硝基咪唑類：包括甲硝唑、替硝唑、奧硝唑等。(9)作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、環(huán)絲氨酸、利福平等。(10)作用于G+細(xì)菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、桿菌肽等.(11)抗真菌抗生素：多烯類、咪唑類、三唑類用于真菌細(xì)胞膜上麥角甾醇的抗真菌藥物、烯丙胺類、氮唑類。(12)抗結(jié)核菌類：利福平、異煙肼、吡嗪酰胺等。(13)具有免疫抑制作用的抗生素如環(huán)孢霉素。第十五頁，共63頁?？咕幬镒饔脵C理

針對細(xì)菌結(jié)構(gòu)，抗菌藥主要有5類作用機理：阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)菌在低滲透壓環(huán)境下膨脹破裂死亡，哺乳動物的細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，不受這類藥物的影響。

第十六頁，共63頁。抗菌藥物作用機理與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，增強細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、打開膜上的離子通道，讓細(xì)菌內(nèi)部的有用物質(zhì)漏出或電解質(zhì)平衡失調(diào)而死亡阻礙細(xì)菌DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌分裂繁殖受阻。第十七頁，共63頁。影響葉酸代謝抑制細(xì)菌葉酸代謝過程中的二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶。導(dǎo)致核酸合成受阻，從而抑制細(xì)菌生長繁殖。與細(xì)菌核糖體或其反應(yīng)底物相互作用，抑制蛋白質(zhì)的合成抗菌藥物作用機理第十八頁，共63頁。主要內(nèi)容細(xì)菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的檢測第十九頁，共63頁。細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生

青霉素的廣泛使用后耐藥性很快產(chǎn)生(β-內(nèi)酰胺環(huán)被破壞后，青霉素的抗菌活性也隨之而消失)，隨后由于抗菌藥物大量使用的壓力，針對各種抗菌藥物的耐藥性逐漸產(chǎn)生。細(xì)菌耐藥性又稱抗藥性，系指細(xì)菌對于抗菌藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的化療作用就明顯下降。耐藥性根據(jù)其發(fā)生原因可分為獲得耐藥性和天然耐藥性。自然界中的病原體，如細(xì)菌的某一株也可存在天然耐藥性。當(dāng)長期應(yīng)用抗生素時，占多數(shù)的敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使細(xì)菌對該種藥物的耐藥率不斷升高。第二十頁，共63頁。細(xì)菌耐藥性20世紀(jì)30年代末磺胺藥上市，40年代臨床廣泛使用磺胺藥后，50年代日本報道80%～90%的志賀痢疾桿菌對磺胺藥耐藥了。20世紀(jì)40年代青霉素剛使用不久即出現(xiàn)耐青霉素金葡菌，50年代發(fā)現(xiàn)金葡菌能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶滅活青霉素，1961年,甲氧西林問世并投入臨床應(yīng)用(抗金葡菌產(chǎn)生的青霉酶)，從甲氧西林使用10余年后，出現(xiàn)耐甲氧西林金葡菌(MRSA)報道。第二十一頁，共63頁。細(xì)菌耐藥性60～70年代，細(xì)菌耐藥性主要表現(xiàn)為金黃色葡萄球菌和一般腸道陰性桿菌由于能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶使青霉素類和一代頭孢菌素抗菌作用下降。80年代后，G-桿菌產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC酶，三代頭孢菌素在內(nèi)的多種抗生素耐藥的多重耐藥革蘭陰性桿菌出現(xiàn)。近年來，出現(xiàn)了萬古霉素中介金葡菌，2002年以來,美國已先后報道了3株對萬古霉素完全耐藥的金葡菌。1990年就有耐亞胺培南的一株陰溝腸桿菌報道，但在隨后10年期間并未有更多耐碳青霉烯類抗生素腸桿菌報道，直到2000年后有關(guān)

CRE的報道不斷增多，一種新抗生素從研制到臨床應(yīng)用一般需要5～10年，而產(chǎn)生細(xì)菌耐藥僅需要2年。第二十二頁，共63頁。細(xì)菌多重耐藥多重耐藥：指細(xì)菌對常用抗菌藥物主要分類的3類或以上藥物耐藥。泛耐藥細(xì)菌：指對所有分類的常用抗菌藥物全部耐藥，革蘭氏陰性桿菌對包括多黏菌素和替加環(huán)素在內(nèi)的全部抗菌藥物耐藥，革蘭氏陽性球菌對包括糖肽類和利奈唑胺在內(nèi)的全部抗菌藥物耐藥。第二十三頁，共63頁。超級細(xì)菌超級細(xì)菌,目前引起特別關(guān)注的超級細(xì)菌主要有：耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）、耐多藥肺炎鏈球菌（MDRSP）、多重耐藥性結(jié)核桿菌（MDR-TB）、最近新發(fā)現(xiàn)的攜帶有NDM-1基因的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌以及多重耐藥鮑曼不動桿菌（MRAB）等。超級細(xì)菌并非新事物，它們一直存在并且隨著人類濫用抗生素而進(jìn)化出強大耐藥性?！俺壖?xì)菌”的出現(xiàn)，一度引起了世界的恐慌。在青霉素被發(fā)現(xiàn)后的半個世紀(jì)，人類走了一圈又回到了原地，來到了多年前有人預(yù)測的“后抗生素時代”。我國是世界上濫用抗生素較為嚴(yán)重的國家,耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù),已占到住院感染患者總?cè)藬?shù)的30%左右。因此有專家預(yù)言,我國有可能率先進(jìn)入“后抗生素時代”，即回到抗生素發(fā)現(xiàn)之前的時代。第二十四頁，共63頁。細(xì)菌多重耐藥為此2011年世界衛(wèi)生組織（WHO）提出了“遏制細(xì)菌耐藥，今天不采取行動，明天就無藥可用”的口號，細(xì)菌耐藥已成為一個極其重要的公共衛(wèi)生安全問題。第二十五頁，共63頁。細(xì)菌耐藥基礎(chǔ)固有耐藥性：是由細(xì)菌染色體基因決定、代代相傳，不會改變的，如鏈球菌對氨基糖苷類抗生素天然耐藥；腸道G-桿菌對青霉素天然耐藥；銅綠假單胞菌及嗜麥芽窄食單胞菌對多數(shù)抗生素均不敏感。獲得性耐藥性：細(xì)菌與抗生素接觸后，在抗菌藥物選擇性壓力存在下經(jīng)過基因突變、潛伏基因的表達(dá),或細(xì)菌在生長過程中通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得抗性基因,或通過移動因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子轉(zhuǎn)移和傳播耐藥基因而獲得的耐藥表型,通過改變自身的代謝途徑，使其不被抗生素殺滅。如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生過多β-內(nèi)酰胺酶或過度表達(dá)mecA基因而耐藥。細(xì)菌的獲得性耐藥可因不再接觸抗生素而消失，也可由質(zhì)粒將耐藥基因轉(zhuǎn)移個染色體而代代相傳，成為固有耐藥。第二十六頁，共63頁。獲得性耐藥性

獲得性耐藥機制更容易將耐藥基因通過水平或垂直傳播方式在不同菌株或不同菌種間傳播，加速了細(xì)菌耐藥蔓延的速度，導(dǎo)致耐藥菌株越來越多，細(xì)菌耐藥性迅速上升，使臨床上不斷出現(xiàn)多重耐藥株、泛耐藥株甚至“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)。在上世紀(jì)50～60年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約700萬，而現(xiàn)在這個數(shù)字上升到了2000萬。死于敗血癥的人數(shù)上升了89%，大部分人死于超級細(xì)菌帶來的用藥困難。第二十七頁，共63頁。細(xì)菌耐藥機制β-內(nèi)酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其N-?；苌锓肿又笑?內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵的滅活酶。細(xì)菌通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶降解是β-內(nèi)酰胺類抗生素是最常見的耐藥方式(80%病原菌耐藥方式之一,至今β-內(nèi)酰胺酶數(shù)量已超過350余種)Ambler等根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶分子結(jié)構(gòu)中氨基酸序列差異分為A，B，C,D。1995年Bush等提出功能分類方案，依據(jù)酶的底物和酶的抑制物不同，主要分為青霉素酶,頭孢菌素酶，廣譜酶和超廣譜酶四種第二十八頁，共63頁。A型β-內(nèi)酰胺酶

A型β-內(nèi)酰胺酶按Bush分類法屬2群，向下又分為8個亞群(2a,2b,2c,2d,2e,2f,2be,2br)，因此，A型β-內(nèi)酰胺酶在底物動力學(xué)性質(zhì)上顯示多樣性。大多數(shù)青霉素類抗生素都是A型β-內(nèi)酰胺酶的良好底物，如氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林和甲氧西林等。從整體上看，A型β-內(nèi)酰胺酶對青霉素類的水解率較頭孢菌素類為高，可引起氨曲南和碳青霉烯類耐藥。此類酶的活性可被克拉維酸等酶抑制劑所抑制，而EDTA不能抑制，引起臨床關(guān)注和危害較大的腸桿菌科細(xì)菌A類碳青霉烯酶主要是KPC酶。第二十九頁，共63頁。B型β-內(nèi)酰胺酶

發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年，依賴金屬離子發(fā)揮催化活性，主要為Zn2+，此酶不被棒酸抑制，被EDTA抑制，其主要特征是除單氨類抗生素（如氨曲南）以外，可水解碳青霉烯酶類等各種

β-內(nèi)酰胺類抗生素，主要包括

NDM-1、IMP、VIM、KHM-1、GIM-1和

SIM-1。對于產(chǎn)

B類酶的菌株的尚無很好的治療手段，值得重視的是對該種酶的檢測，以防止其爆發(fā)流行。第三十頁，共63頁。C型β-內(nèi)酰酶

C型β-內(nèi)酰酶通常被稱為頭孢菌素酶1989首次發(fā)現(xiàn)，按Bush分類法屬1群。第1代頭孢菌素是C型β-內(nèi)酰胺酶的良好底物，第2、3代頭孢菌素一般對C型β-內(nèi)酰胺酶不敏感。亞胺培南和氨曲南則表現(xiàn)出對C型β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用。主要包括CMY、FOX、MOX、LAT、ACT、ACC、MIR和DHA第三十一頁，共63頁。D型β-內(nèi)酰胺酶

D型β-內(nèi)酰胺酶Bush分類屬2d群，它們對苯唑西林和氯唑西林的水解速度明顯大于芐青霉素，因此，它們又被稱為“苯唑西林酶”，其中OXA-48在碳青霉烯類耐藥中顯示出了日趨重要的碳青霉烯酶的活性。第三十二頁，共63頁。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBLs是一大類基于TEM-1、TEM-2和

SHV-1型β內(nèi)酰胺酶基礎(chǔ)上經(jīng)突變而成的多種β-內(nèi)酰胺酶，水解青霉素、廣譜青霉素、頭孢菌素、單環(huán)類、第四代頭孢菌素，但不能水解碳青霉烯類、頭霉素類。除了對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外，經(jīng)常伴隨對氨基糖苷類等其他抗生素的耐藥性。準(zhǔn)確區(qū)分ESBLs和非ESBLs菌株，不僅可指導(dǎo)臨床合理用藥，以免延誤病情和增加醫(yī)療費用，而且有利于對ESBL菌株的管理，控制其傳播，防止爆發(fā)流行，對提高治療效果和控制醫(yī)院院內(nèi)感染均有重要意義。第三十三頁，共63頁。AmpC酶

G-桿菌產(chǎn)生的不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶組成的一個酶家族,屬于β-內(nèi)酰胺酶分子分類中的C類。產(chǎn)AmpC酶的耐藥菌幾乎對所有的β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥,對第4代頭孢菌素如頭孢吡肟敏感,對碳青霉烯類如亞胺培南、美羅培南有高度的活性。

AmpC酶可分為質(zhì)粒介導(dǎo)型和染色體介導(dǎo)型。質(zhì)粒AmpC基因來源于幾種腸桿菌科細(xì)菌染色體AmpC基因,其AmpC沒有調(diào)控基因,呈持續(xù)高表達(dá),且質(zhì)粒編碼常同時攜帶有其他的耐藥基因,因而導(dǎo)致多重耐藥,并且傳播很快,主要在大腸埃希菌、肺炎克雷白桿菌、沙門菌屬和志賀菌屬中出現(xiàn)。染色體介導(dǎo)的AmpC酶能水解第3代頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素,其高水平表達(dá)與調(diào)節(jié)基因突變有關(guān),當(dāng)AmpD基因突變產(chǎn)生有缺陷的AmpD蛋白時,可引起AmpC過度表達(dá),使產(chǎn)酶量大增引起耐藥,多見于陰溝腸桿菌。第三十四頁，共63頁。氨基糖苷修飾酶乙?；D(zhuǎn)移化酶(AAC)、磷酸轉(zhuǎn)化酶

(APH)和腺苷酸轉(zhuǎn)化酶(ANT)。人們一直認(rèn)為耐藥菌株產(chǎn)生的氨基糖苷類修飾酶是主要的耐藥機制，但臨床分離致病菌株16SrRNA甲基化酶的發(fā)現(xiàn)改變了人們的觀點。此酶可由質(zhì)粒介導(dǎo)進(jìn)行垂直和或水平播散，使細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生多藥交叉耐藥及高水平耐藥，給臨床醫(yī)生治療革蘭氏陰性桿菌感染帶來更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。第三十五頁，共63頁。抗生素作用的靶位點發(fā)生突變細(xì)菌通過對特定位點的突變，改變了與抗菌藥物結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生了新的不能與抗生素結(jié)合的替代物質(zhì)，或產(chǎn)生了保護(hù)性的物質(zhì)阻止了抗生素的結(jié)合而逃避抗生素的作用。鏈霉素結(jié)合部位是30S亞基上的SI2蛋白,若SI2蛋白的構(gòu)型改變,使鏈霉素不能與其結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性；紅霉素靶部位是50S亞基的L4或L12蛋白,當(dāng)染色體上的ery基因突變,使L4或L12蛋白構(gòu)型改變,便會出現(xiàn)對紅霉素的耐藥性；利福平作用點是RNA聚合酶的β基因,當(dāng)其突變時,就產(chǎn)生了耐藥性；青霉素靶部位是細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs),PBPs具有酶活性,參與細(xì)胞壁的合成,是β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位,細(xì)菌改變了PBPs的結(jié)構(gòu),可導(dǎo)致耐藥性；喹諾酮類藥物靶部位是DNA旋轉(zhuǎn)酶,當(dāng)基因突變引起酶結(jié)構(gòu)的改變,阻止喹諾酮類藥物進(jìn)入靶位,可造成喹諾酮類所有藥物的交叉耐藥。第三十六頁，共63頁。外膜通透性改變一些具有高滲透性外膜、對抗菌藥物原來敏感的細(xì)菌,可以通過降低外膜的滲透性而出現(xiàn)耐藥性。如原來允許某種抗菌藥物通過的孔蛋白通道由于細(xì)菌發(fā)生突變而使該孔蛋白通道關(guān)閉或消失，細(xì)菌就會對該抗菌藥物產(chǎn)生很高的耐藥性。此種耐藥機制往往對抗菌藥物特異性較差，具有多重耐藥性，銅綠假單胞菌的外膜對多種抗菌藥物如β內(nèi)酰胺類、酶抑制劑、四環(huán)素、氯霉素和喹諾酮類的通透性極低，而導(dǎo)致先天耐藥。第三十七頁，共63頁。主動外排作用

主動外排作用是微生物對藥物產(chǎn)生耐藥性的一個重要機制，源于20世紀(jì)80年代關(guān)于大腸埃希菌對四環(huán)素耐藥機制的研究,它是由藥物外輸泵來完成的。藥物外輸泵是一類位于細(xì)胞膜上的具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，其作用機理為當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度聚集達(dá)到一定數(shù)值時，藥物外輸泵系統(tǒng)相關(guān)mRNA的表達(dá)增加，結(jié)果使細(xì)胞膜上外輸泵的數(shù)量增加,使細(xì)胞內(nèi)的藥物被泵出。外排系統(tǒng)廣泛存在于G+

菌、G-菌、真菌及哺乳類細(xì)胞(如癌細(xì)胞)中,其與細(xì)菌外膜通透性改變在多重耐藥中起重要作用,愈來愈受到研究者重視。第三十八頁，共63頁。細(xì)菌生物膜的作用細(xì)菌生物膜(BF)是指細(xì)菌吸附于生物材料或機體腔道表面,分泌多糖蛋白復(fù)合物,并將自身包繞其中形成的膜樣物質(zhì)。細(xì)菌在BF的保護(hù)下可逃避抗菌藥物的殺傷作用和免疫細(xì)胞的吞噬作用。與浮游菌比較,BF細(xì)菌對抗生素的抗藥性可提高10～1000倍,其主要取決于BF多細(xì)胞結(jié)構(gòu):①BF中的胞外多糖起屏障作用,限制抗生素分子向細(xì)菌運輸;②BF中微環(huán)境的不同可影響抗生素的活性;③BF細(xì)菌表面生長可誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)出與浮游細(xì)菌不同的基因,誘導(dǎo)產(chǎn)生BF特異性表型;④多菌種BF中各菌種的協(xié)同作用。具有生物膜的細(xì)菌多見于銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、變異鏈球菌。第三十九頁，共63頁。轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥性

轉(zhuǎn)座子(Tn)是一種比質(zhì)粒更小的DNA片段,它能夠隨意地插入或躍出其他DNA分子中,通常借助細(xì)菌的染色體、噬菌體或質(zhì)粒得以復(fù)制并插入到新的位點,或?qū)⒆陨韽脑稽c剪切掉再插入到新的位點,從而使宿主細(xì)胞失去對抗菌藥物的敏感性。在細(xì)菌對萬古霉素的耐藥性機制研究中發(fā)現(xiàn)VanA基因存在于Tn1546中,這一轉(zhuǎn)座子含有9個基因,其中有2個編碼萬古霉素耐藥基因的“VanA基因簇”。Tn還可以使位于染色體上和非接合質(zhì)粒上的基因轉(zhuǎn)移到接合質(zhì)粒中,實現(xiàn)細(xì)菌間的基因轉(zhuǎn)移或交換。此外,耐藥基因的轉(zhuǎn)移和傳播也可以通過轉(zhuǎn)座子、整合子和質(zhì)粒等可移動的遺傳元件介導(dǎo)。第四十頁，共63頁。細(xì)菌整合子系統(tǒng)

整合子(integron)是近年來發(fā)的新的可移動基因元件,是捕獲外源基因并使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_(dá)單位。整合子的基本結(jié)構(gòu)由1個編碼整合酶的基因、2個基因重組位點、啟動子和耐藥基因盒組成?；蚝惺菃我坏目梢苿拥腄NA分子,是由一個開放閱讀框(ORF基因)和一個反向不完全重復(fù)序列即59-堿基(59-be)單元組成,59-be是整合酶的識別位點。只有當(dāng)基因盒被整合子捕獲并整合到整合子中才能轉(zhuǎn)錄,一個整合子可以捕獲一個或多個基因盒。第四十一頁，共63頁。主要內(nèi)容細(xì)菌與人類關(guān)系抗菌藥物應(yīng)用細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的檢測第四十二頁，共63頁。耐藥檢測標(biāo)準(zhǔn)

美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)針對每種細(xì)菌CLSI會提供質(zhì)控參考菌株的MIC，檢測的藥物種類，敏感、中介和耐藥的濃度第四十三頁，共63頁。瓊脂稀釋法(MIC法)

瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。第四十四頁，共63頁。紙片擴散法

紙片擴散法又稱瓊脂擴散法，將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。第四十五頁，共63頁。Etest試驗

金標(biāo)準(zhǔn)的藥敏方法,它的特點是結(jié)合瓊脂擴散法和稀釋法的優(yōu)點,濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條向瓊脂中擴散，在試條周圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。是用擴散法的原理,塑料條的形式定量讀出MIC值。這比傳統(tǒng)的紙片擴散法測抑菌圈的大小精確可靠。第四十六頁，共63頁。自動分析儀

自動分析儀器待鑒定細(xì)菌藥敏卡第四十七頁，共63頁。ESBLs檢測紙片確認(rèn)試驗：CLSI標(biāo)準(zhǔn)，CAZ/CLA，CTX/CLA兩組藥敏紙片確認(rèn)，結(jié)果抑菌環(huán)直徑差值>5mm。E-test法：一端是CAZ(0.5-32ug/ml),另一端是CAZ(0.125-8ug/ml)/CLA(4ug/ml),CAZ與CAZ/CLA的MIC比值>4。第四十八頁，共63頁。PCR方法檢測耐藥基因

單重PCR：細(xì)菌耐藥性的靈敏性和特異性明顯高于傳統(tǒng)藥敏實驗。最大不足之處在于檢測的指標(biāo)過于單一。多重PCR方法檢測耐藥基因：多重PCR可以實現(xiàn)多目標(biāo)耐藥基因的檢測。第四十九頁，共63頁?；蛐酒谀退幓驒z測

DNA芯片與多重PCR結(jié)合,可用于多種耐藥基因的檢測。臨床革蘭氏陰性細(xì)菌,尤其腸桿菌科細(xì)菌中,由于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶以及頭孢菌素酶的流行,導(dǎo)致致病菌對主要的一線常用藥β-內(nèi)酰胺類抗生素高度耐藥。因此對介導(dǎo)這些耐藥的耐藥基因進(jìn)行檢測,有很大的臨床意義。第五十頁，共63頁?；驕y序

Sanger法因為既簡便又快速，并經(jīng)過后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止DNA測序的主流。第二代測序技術(shù)是費用更低、通量更高、速度更快的測序技術(shù)，應(yīng)運而生，二代測序的基本原理是邊合成邊測序。第五十一頁，共63頁。MRSA紙片擴散法:苯唑西林在貯存過程中藥效不易降低，且對不均一耐藥性檢測效果更好，所以國內(nèi)多數(shù)實驗室都采用苯唑西林，苯唑西林含量為1μg/片，抑菌圈≤10mm為耐藥，≥13mm為敏感，11～12mm為中介。瓊脂稀釋(MIC)法:

MIC<2μg/ml為敏感，>4μg/ml為耐藥。濃度梯度(Etest)法瓊脂篩選法:即MH培養(yǎng)基加NaCl(40g/L)加苯唑西林(6μg/ml)，將菌液點種或畫線孵育24h，只要平皿有菌生長，即使一個菌落也是MRSA，該法敏感度為100%。PCR技術(shù):金黃色葡萄球菌耐苯唑西林的耐藥水平與mecA基因有較好的相關(guān)性。第五十二頁，共63頁。近3年我院血培養(yǎng)G-細(xì)菌情況革蘭陰性細(xì)菌名稱株數(shù)（株）構(gòu)成比（%）大腸埃希菌13954.3肺炎克雷伯菌3814.84銅綠假單胞菌249.38鮑曼不動桿菌145.47陰溝腸桿菌114.3嗜麥芽食單胞菌51.95傷寒沙門氏菌51.95其他革蘭陰性細(xì)菌207.81總計256100第五十三頁，共63頁。近3年我院血培養(yǎng)G-菌耐藥率抗菌藥物大腸埃希菌（n=139）肺炎克雷伯菌（n=38）銅綠假單胞菌（n=24）鮑曼不動桿菌（n=14）陰溝腸桿菌（n=11）阿米卡星15.1%（21）21.1%（8）58.3%（14）64.3%（9）36.4%（4）氨芐青霉素87.1%（121）100%（38）91.7%（22）100%（14）—氨芐青霉素/舒巴坦67.6%（94）89.5%（34）83.3%（20）100%（14）—氨曲南57.6%（80）73.7%（28）79.2%（19）85.7%（12）63.6%（7）頭孢唑啉97.1%（135）100%（38）100%（24）100%（14）100%（11）頭孢曲松61.2%（85）73.7%（28）83.3%（20）85.7%（12）90.9%（10）頭孢他啶59.7%（83）86.8%（33）58.3%（14）85.7%（12）72.7%（8）環(huán)丙沙星71.9%（100）86.8%（33）87.5%（21）100%（14）90.9%（10）頭孢吡肟20.1%（28）31.6%（12）—85.7%（12）63.6%（7）頭孢呋辛74.1%（103）78.9%（30）—92.9%（13）81.8%（9）第五十四頁，共63頁。近3年我院血培養(yǎng)G-菌耐藥率抗菌藥物大腸埃希菌（n=139）肺炎克雷伯菌（n=38）銅綠假單胞菌（n=24）鮑曼不動桿菌（n=14）陰溝腸桿菌（n=11）磷霉素31.7%（44）42.1%（16）——18.2%（2）慶大霉素75.5%（105）84.2%（32）—85.7%（12）63.6%（7）亞胺培南4.3%（6）5.3%（2）8.3%（2）42.9%（6）0%（0）左氧氟沙星77.7%（108）92.1%（35）95.8%（23）—90.9%（10）美羅培南4.3%（6）5.3%（2）—42.9%（6）0%（0）頭孢哌酮/舒巴坦6.5%（9）13.2%（5）—50.0%（7）45.5%（5）復(fù)方新諾明86.3%（120）97.8%（37）——81.8%（9）替加環(huán)素0%（0）0%（0）—7.1%（1）0%（0）妥布霉素36.0%（50）55.3%（21）50.0%（12）71.4%（10）45.5%（5）哌拉西林/他唑巴坦11.5%（16）28.9%（11）41.7%（10）64.3%（9）—第五十五頁，共63頁。近3年我院血培養(yǎng)G+性細(xì)菌情況細(xì)菌種類細(xì)菌名稱株數(shù)（株）構(gòu)成比（%）革蘭陽性細(xì)菌35155.28表皮葡萄球菌10416.38金黃色葡萄球菌7611.97人葡萄球菌人亞種538.36草綠色溶血性鏈球菌385.98溶血性葡萄球菌314.88腸球菌屬182.83革蘭陽性桿菌60.94其他革蘭陽性細(xì)菌253.94第五十六頁，共63頁。近3年我院血培養(yǎng)G+菌耐藥率抗菌藥物表皮葡萄球菌（n=104）金黃色葡萄球菌（n=76）人葡萄球菌人亞種（n=53）草綠色溶血鏈球菌（n=38）溶血性葡萄球菌（n=18）氨芐青霉素66.3%（69）56.6%（43）49.1%（26）—55.6%（10）阿莫西林/棒酸62.5%（65）68.4%（52）60.4%（32）—38.9%（7）頭孢曲松31.7%（33）40.8%（31）26.4%（14）18.4%（7）22.2%（4）克林霉素50.0%（52）58.0%（44）47.2%（25）50.0%（19）27.8%（5）環(huán)丙沙星37.5%（39）52.6%（40）34.0%（18）—38.9%（7）紅霉素56.7%（59）53.9%（41）49.1%（26）55.3%（21）72.2%（13）慶大霉素62.5%（65）60.5%（46）54.7%（29）—61.1%（11）左氧氟沙星44.2%（46）48.7%（37）56.7%（30）—44.4%（8）利奈唑胺0%（0）0%（0）0%