抗生素生產(chǎn)工藝系列3課件

抗生素工業(yè)生產(chǎn)第二部分1菌種優(yōu)化抗生素發(fā)酵及提取精制工業(yè)生產(chǎn)方法及總的工藝抗生素生產(chǎn)菌的菌種菌種來源抗生素工業(yè)生產(chǎn)

內(nèi)容速覽2抗生素的工業(yè)生產(chǎn)方法

及工藝介紹第一節(jié)3工業(yè)生產(chǎn)方法

生物合成法全化學(xué)合成法半化學(xué)合成法一、抗生素的工業(yè)生產(chǎn)方法51、生物合成法

生物合成法（即微生物發(fā)酵法）：是利用特定的微生物，在一定的條件下（培養(yǎng)基、溫度、pH、通氣、攪拌等）使之生長繁殖，并在代謝過程中產(chǎn)生抗生素。然后選用適當(dāng)化學(xué)手段將抗生素從發(fā)酵液中提取、精制，最后獲得符合藥典規(guī)定的各種抗生素成品。67①傳統(tǒng)方法

傳統(tǒng)方法目前存在很多不足，因此，人們采用基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)，對抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行了改造和重新設(shè)計(jì)，不僅可以制造出許多高效低毒的新型抗生素，還可改革工藝，使抗生素產(chǎn)量成倍地增長。大多數(shù)抗生素是由放線菌產(chǎn)生的。菌種通過從土壤中分離、篩選獲得，一般采用深層通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐生產(chǎn)。9②“工程菌”制造法我國新構(gòu)建的生產(chǎn)丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把?；富蚩寺〉娇敲顾禺a(chǎn)生菌中獲得的。新的“工程菌”生產(chǎn)的新抗生素毒副作用小，對耐卡那霉素、慶大霉素致病菌臨床療效顯著。第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麥迪紫紅素A，是美國報(bào)道的。他們將產(chǎn)放線紫紅素的部分基因插入產(chǎn)麥迪霉素的放線菌中，構(gòu)建的“工程菌”產(chǎn)生了全新的抗生素。10③細(xì)胞融合技術(shù)法

目前DNA重組技術(shù)已廣泛用于紅霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種工作，可以預(yù)見不久將來會有更多的新型抗生素問世。對抗生素產(chǎn)生菌采用細(xì)胞融合技術(shù)的成果更為突出。橄欖色無孢小單孢菌細(xì)胞融合株抗生素產(chǎn)率比原菌株提高140倍。

返回11氯霉素分子結(jié)構(gòu)圖13氯霉素的合成

14合成路徑為起始原料溴代——成鹽——水解成胺——酯化——羥醛縮合——選擇性還原（±）蘇阿糖型——酯水解——酸堿中和——拆分——D（-）蘇阿糖型——成酰胺15缺點(diǎn)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。

返回173、半化學(xué)合成法

即半合成法，將生物合成法制得的抗生素用化學(xué)或生化方法引入特定的功能基團(tuán),進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造而獲得的新抗生素品種或制成各種衍生物。18Ⅰ:生物合成法制?、?化學(xué)方法改造半化學(xué)合成法此種方法一般分兩個(gè)階段進(jìn)行：19

半合成抗生素的目的：增強(qiáng)抗菌力；12對耐藥菌有效；34降低毒副作用或提高生物有效性。5擴(kuò)大抗菌譜；便于口服；21二、生物合成法生產(chǎn)抗生素的工藝過程22抗生素總的生產(chǎn)工藝過程菌種孢子制備種子制備發(fā)酵精制過程成品檢驗(yàn)提取過程 成品包裝發(fā)酵液預(yù)處理及過濾 出廠檢驗(yàn)23251、產(chǎn)生菌種★菌種：來源于自然界，得到能產(chǎn)生抗生素的微生物，經(jīng)分離、選育和純化后的物質(zhì)；★

保藏：冷凍干燥法制備后，以超低溫，即在液氮冰箱(-190℃~-196℃)內(nèi)保藏；★

復(fù)壯：一般生產(chǎn)用菌株經(jīng)多次移植往往會發(fā)生變異而退化，故必須經(jīng)常進(jìn)行菌種選育和純化以提高其生產(chǎn)能力。26種子擴(kuò)培工藝流程1.砂土孢子2.冷凍干燥孢子3.斜面孢子4.藥瓶液體培養(yǎng)5.茄子瓶斜面培養(yǎng)6.固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7、8.種子罐培養(yǎng)9.發(fā)酵罐29★在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，由于各菌種的生理生化特性不一樣，采用的工藝不同，所需的培養(yǎng)基組成亦各異。★即使同一菌種，在種子培養(yǎng)階段和不同發(fā)酵時(shí)期，其營養(yǎng)要求也不完全一樣?！锱囵B(yǎng)基主要成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽類(包括微量元素)和前體等。4、培養(yǎng)基的配制30

(1)碳源

主要用以供給菌種生命活動所需的能量，構(gòu)成菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物。有的碳源還參與抗生素的生物合成，是培養(yǎng)基中主要組成之一；常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂類。31(2)氮源主要用以構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)(包括氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸)和含氮代謝物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。有機(jī)氮源：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉和菌絲體等。無機(jī)氮源：氨水(氨水既作為氮源，也用以調(diào)節(jié)pH)，硫酸銨、硝酸鹽和磷酸氫二氨等。32(3)無機(jī)鹽和微量元素抗生素產(chǎn)生菌和其他微生物一樣，在生長、繁殖和產(chǎn)生生物產(chǎn)品的過程中，需要某些無機(jī)鹽類和微量元素。如硫、磷、鎂、鐵、鉀、鈉、鋅、銅、鈷、錳等，其濃度與菌種的生理活性有一定影響。33

(4)前體(precursor)

定義：在抗生素生物合成中，菌體利用它以構(gòu)成抗生素分子中的一部分而其本身又沒有顯著改變的物質(zhì)。前體除直接參與抗生素生物合成外，在一定條件下還控制菌體合成抗生素的方向并增加抗生素的產(chǎn)量。前體的加入量應(yīng)當(dāng)適度。34

(5)培養(yǎng)基的質(zhì)量

1）在必要時(shí)作搖瓶試驗(yàn)以控制其質(zhì)量；2）培養(yǎng)基的儲存條件對培養(yǎng)基質(zhì)量的影響；3）培養(yǎng)基滅菌過程中溫度過高、受熱時(shí)間過長亦能引起培養(yǎng)基成分的降解或變質(zhì)；4）培養(yǎng)基初始pH亦要嚴(yán)格按規(guī)程執(zhí)行。355、發(fā)酵★定義：利用為生物體的代謝作用，并借助于代謝過程的控制來獲得產(chǎn)品的過程?！锬康模菏刮⑸锎罅糠置诳股亍?65、發(fā)酵★滅菌：在發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基也必須先經(jīng)過滅菌后再接入種子?！锝臃N：將活化的菌種轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)基，接種量一般為10%或10%以上。3738★發(fā)酵控制1）發(fā)酵時(shí)間：視抗生素品種和發(fā)酵工藝而定。2）溶氧：在整個(gè)發(fā)酵過程中，需不斷通無菌空氣和攪拌，以維持一定罐壓或溶氧。3）控制灌溫：在罐的夾層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。4）消泡：加泡沫劑以控制泡沫，必要時(shí)還加入酸、堿以調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。39★發(fā)酵控制

檢測指標(biāo)：定時(shí)取樣進(jìn)行生化分析、鏡檢和無菌試驗(yàn)。分析或控制的參數(shù)有菌絲形態(tài)和濃度、殘?zhí)橇?、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速和液面控制等。對有的抗生素在發(fā)酵過程中還需加入葡萄糖、銨鹽或前體，以促進(jìn)抗生素的產(chǎn)生。40★目的：分離菌絲、去除雜質(zhì)；★多數(shù)抗生素品種在生產(chǎn)過程中，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時(shí)，抗生素存在于發(fā)酵液中；★個(gè)別品種當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時(shí)抗生素大量殘存在菌絲之中，在此情況下，發(fā)酵液的預(yù)處理應(yīng)當(dāng)包括使抗生素從菌絲中析出，使其轉(zhuǎn)入發(fā)酵液。

6、發(fā)酵液的過濾和預(yù)處理41發(fā)酵液的預(yù)處理★加熱、大幅度調(diào)pH和加絮凝劑等方法使蛋白質(zhì)變性；★加入草酸、三聚磷酸鈉（Na5P3O10）、黃血鹽等可除去Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e2+等無機(jī)離子。42發(fā)酵液的過濾板框過濾機(jī)鼓式真空過濾機(jī)43自動出渣離心機(jī)傾析器發(fā)酵液的過濾447、抗生素的提取提取目的：從發(fā)酵液中制取高純度的符合藥典規(guī)定的抗生素成品。提取要求：1)時(shí)間短；2)溫度低；3)pH宜選擇對抗生素較穩(wěn)定的范圍；4)勤清洗消毒(包括廠房、設(shè)備、管路并注意消滅死角)。提取方法：1)溶媒萃取法；2)離子交換法；3)其他提取方法45溶媒萃取法

利用抗生素在不同pH條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)(游離酸、堿或成鹽)存在時(shí)，在水及與水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素從一種液相(如發(fā)酵濾液)轉(zhuǎn)移到另一種液相(如有機(jī)溶媒)中去，以達(dá)到濃縮和提純的目的。46★離子交換法

利用某些抗生素能解離為陽離子或陰離子的特性，使其與離子交換樹脂進(jìn)行交換，將抗生素吸附在樹脂上，然后再以適當(dāng)?shù)臈l件將抗生素從樹脂上洗脫下來。47缺點(diǎn)：生產(chǎn)周期長，對某些產(chǎn)品質(zhì)量不夠理想優(yōu)點(diǎn)：成本低、設(shè)備簡單、操作方便離子交換法48其他提取方法

由于近年來許多抗生素發(fā)酵單位已大幅度提高，提取方法亦相應(yīng)適當(dāng)簡化。直接沉淀法就是提取抗生素的方法中最簡單的一種。例：四環(huán)素的提取

498、抗生素的精制

對產(chǎn)品進(jìn)行精制、烘干和包裝階段要符合“藥品生產(chǎn)管理規(guī)范”（GMP）的規(guī)定。50抗生素精制的方法

1、脫色和去熱原質(zhì)2、結(jié)品和重結(jié)晶

A.改變溫度結(jié)晶B.利用等電點(diǎn)結(jié)晶C.加成鹽劑結(jié)晶D.加入不同溶劑結(jié)晶

3、其他精制方法511、脫色和去熱原質(zhì)色素是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，與菌種及發(fā)酵條件有關(guān)，常用活性炭脫色。

熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過程中由于被污染后由雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。G-產(chǎn)生的熱原反應(yīng)高于G+，是多糖磷類脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合體，引起惡寒高熱，甚至休克。常用活性炭吸附或超微過濾辦法去除。52

2、結(jié)晶和重結(jié)晶A.改變溫度結(jié)晶

利用抗生素在溶劑中的溶解度隨溫度變化而顯著變化的這一特性來進(jìn)行結(jié)晶。例:制霉菌素的濃縮液在5℃條件下保持4-6h后即結(jié)晶完全，分離掉母液、洗滌、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。53

當(dāng)將某一抗生素溶液的pH調(diào)到等電點(diǎn)時(shí)，它在水溶液中溶解度最小，則沉淀析出。

例：6-氨基青霉烷酸(6-APA)水溶液當(dāng)pH調(diào)至等電點(diǎn)(4.3)時(shí)，6-APA即從水溶液中沉淀析出。B.利用等電點(diǎn)結(jié)晶54C.加成鹽劑結(jié)晶

在抗生素溶液中加成鹽劑(酸、堿或鹽類)使抗生素以鹽的形式從溶液中沉淀結(jié)晶。

例：在青霉素G或頭孢菌素C的濃縮濃中加入醋酸鉀、即生成鉀鹽析出。55D.加入不同溶劑結(jié)晶

利用抗生素在不同溶劑中溶解度大小的不同，在抗生素某一溶劑的溶液中加入另一溶劑使抗生素析出。

例：巴龍霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的性質(zhì)。在其濃縮液中加入10-12倍體積的95%乙醇，并調(diào)PH至7.2-7.3使其結(jié)晶析出。563、其他精制方法(1)共沸蒸餾法(2)柱層析法(3)鹽析法(4)中間鹽轉(zhuǎn)移法(5)分子篩579、成品檢驗(yàn)

《中華人民共和國藥典》抗生素成品常規(guī)檢驗(yàn)的主要項(xiàng)目有：①鑒別實(shí)驗(yàn)：用化學(xué)或生物方法證明是何種抗生素；②效價(jià)測定：測定有效成分的含量；③毒性試驗(yàn)：限制產(chǎn)品中的致毒雜質(zhì)；④無菌實(shí)驗(yàn)：檢查有無雜菌污染；58⑤熱原質(zhì)試驗(yàn)：限制產(chǎn)品中致熱雜質(zhì)；⑥水分測定：限制過高水分，以免影響穩(wěn)定性；⑦pH測定：規(guī)定水溶液的酸堿度，保證產(chǎn)品穩(wěn)定和臨床的安全應(yīng)用；⑧溶液澄清度檢查：限制不溶性雜質(zhì)混入；⑨降壓試驗(yàn)：限制降低血壓的雜質(zhì)。5910、成品的分包裝就是將大包裝原料藥進(jìn)行小包裝或加工成多種類型的抗生素劑型，如果是注射用的抗生素劑型，還必須在無菌條件下進(jìn)行。60抗生素工業(yè)生產(chǎn)特點(diǎn)三、抗生素工業(yè)生產(chǎn)特點(diǎn)611菌體的生長與產(chǎn)物的形成不平行2理論產(chǎn)量難以用物料平衡來計(jì)算3生產(chǎn)穩(wěn)定性差62四、與一般制藥工業(yè)相比較的特殊問題631、染菌問題：克服染菌是發(fā)酵成敗的重要因素，染菌問題雖已得到重視，但由于設(shè)計(jì)技術(shù)、設(shè)備、管理、操作等方面的因素，有待繼續(xù)進(jìn)行研究和解決。642、糧食消耗問題★每生產(chǎn)一公斤抗生素，往往要消耗25-200公斤糧食；★解決糧耗問題要從提高生產(chǎn)水平著手，如篩選高產(chǎn)菌株、降低染菌率、采用合理的培養(yǎng)基配方、以粗糧或非糧原料替葡萄糖、乳搪、蛋白陳等，以合成消沫劑代替食用油，降低發(fā)酵終止時(shí)的殘?zhí)?，改進(jìn)發(fā)酵工藝、不斷提高提取收率。653、動力消耗問題蒸汽、壓縮空氣、水、電等是抗生素生產(chǎn)必須具備的耗能四大公用系統(tǒng)。因此，如何從提高產(chǎn)量、降低消耗、節(jié)約能源方面進(jìn)行