重要分離方法

第三節(jié)中藥化學(xué)成分的分離方法中藥化學(xué)成分經(jīng)提取濃縮后，得到的仍是含有多種成分的混合物，需選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑵渲兴鞣N成分逐一分開，并把所得單體加以精制純化，這一過程稱為分離。一、兩相溶劑萃取法

兩相溶劑萃取法簡稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種不相混溶的溶劑中分配系數(shù)的不同達(dá)到分離的方法。分配系數(shù)是指在一定溫度時(shí)，一種物質(zhì)溶解在相互接觸但不混溶的兩相溶劑中，溶解平衡后，兩溶劑中溶質(zhì)濃度的比值。此比值在一定的溫度及壓力下為一常數(shù)，可以用下式表示：Ｋ－分配系數(shù)CH－物質(zhì)在上層溶劑中的濃度CL－物質(zhì)在下層溶劑中的濃度

混合物中各成分在兩相溶劑中，分配系數(shù)相差越大，分離效果越好。``````````````````````````````````````（一）簡單萃取法是分離物質(zhì)最簡單最基礎(chǔ)的手段，常用于初步分離。（二）逆流連續(xù)萃取法是一種兩相溶劑逆行的連續(xù)萃取方法。其裝置如圖2-5逆流分溶法因操作條件溫和、試樣易回收，故特別適合于中等極性、不穩(wěn)定、性質(zhì)相似成分的分離。另外，溶質(zhì)濃度越低，分離效果越好。但試樣極性過大或過小，或分配系數(shù)受濃度或溫度影響過大時(shí)，則不易采用此法分離。易于乳化的萃取溶劑系統(tǒng)也不易采用此法。（四）液滴逆流分配法（DropletCounterCurrentChromatography，DCCC）

這是在逆流分溶法基礎(chǔ)上改進(jìn)發(fā)展起來的一種高分離效能的兩相溶劑萃取法。利用混合物中各成分在兩液相間分配系數(shù)的差別，由流動相形成液滴，通過作為固定相的液體柱而達(dá)到分離純化的目的。其裝置示意圖見2-7影響液滴逆流分配的主要因素有：①被分離成分在兩相溶劑間的分配系數(shù)要大；②形成大小合適的移動相液滴，這與兩相間的界面張力、密度差、輸液管口徑和萃取管材料等有關(guān)，可以采用數(shù)根萃取管預(yù)試液滴的形成情況而確定；③液滴間的間隔，與泵的送液速度有關(guān)，送液速度過快，液滴間幾無間隔變成線流通過固定相，通常也可經(jīng)過小樣探索而定。液滴逆流分配法的分離效果往往比逆流分溶法好，且不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。移動相用氮?dú)怛?qū)動，被分離物質(zhì)不會因遇空氣中氧而氧化。應(yīng)用該法曾滿意地分離純化多種成分，如皂苷、生物堿、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及糖類等。1．超臨界流體的特性與種類

超臨界流體是指物質(zhì)在高于其臨界溫度（TC）和臨界壓力（PC）時(shí)所形成的單一相態(tài)。處于超臨界狀態(tài)的物質(zhì)既不是液體，也不是氣體，理化性質(zhì)介于液體和氣體之間，其特性表現(xiàn)為：①超臨界流體的密度比氣體大，而與液體密度相近，因此分子間距離縮短，分子間相互作用大大增強(qiáng)，溶解作用近似于液體；②粘度低于液體而與氣體的粘度相近，擴(kuò)散系數(shù)卻比液體大10～100倍，有利于成分的擴(kuò)散溶解；③超臨界流體的密度、粘度和擴(kuò)散系數(shù)等，都與溫度、壓力和流體組成有關(guān)?？捎米鞒R界流體的物質(zhì)很多，如二氧化碳、一氧化氮、甲烷、乙烷、六氟化硫、氨等。目前使用最為廣泛的是二氧化碳，其臨界溫度（31.3℃）低，可在常溫下操作，并對大部分物質(zhì)呈化學(xué)惰性。這樣，使中藥中的化學(xué)成分能在低溫條件下安全地被萃取出來，有效地防止了“熱敏性”或化學(xué)不穩(wěn)定性成分的氧化和逸散，使萃取物保持中藥的全部成分。2．基本原理超臨界流體萃取的原理主要是根據(jù)超臨界流體對物質(zhì)有很強(qiáng)的溶解能力，且改變溫度或壓力即可改變流體的密度、粘度和擴(kuò)散系數(shù)，流體對物質(zhì)的溶解特性也隨之改變，因此，可將不同性質(zhì)的成分分段萃取或分步析出，達(dá)到萃取分離的目的。3．超臨界流體萃取法的應(yīng)用超臨界流體萃取法始于20世紀(jì)50年代，到70年代末，該法廣泛應(yīng)用于煙草和食品工業(yè)，80年代以來，超臨界流體萃取技術(shù)在醫(yī)藥、化工、食品及環(huán)保等領(lǐng)域取得了迅速發(fā)展，特別是在中藥有效成分提取分離方面日益受到重視。目前主要用于萜類、揮發(fā)油、生物堿、黃酮、苯丙素、皂苷和芳香有機(jī)酸等成分的提取分離。在青蒿素浸膏、蛇床子浸膏、胡椒精油、肉豆蔻精油等的制備分離方面已達(dá)到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。三、沉淀法沉淀法是在中藥提取液中加入某些試劑，與其中一些成分生成沉淀，或加入某些試劑后可降低一些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一種方法如果所需要分離獲得的成分生成沉淀，則沉淀反應(yīng)必須是可逆的；如果是不需要的成分，則將生成的沉淀除去，可以是不可逆的沉淀反應(yīng)。（一）乙醇沉淀法此法是在濃縮后的水提取液中，加入一定量的乙醇，使某些難溶于乙醇的成分從溶液中沉淀析出的方法（二）酸堿沉淀法本法是利用某些成分在酸（或堿）中溶解，而在堿（或酸）中沉淀的性質(zhì)達(dá)到分離的方法。脫鉛方法1．通入硫化氫氣體法2．硫酸鹽或磷酸鹽3．陽離子交換樹脂法（四）鹽析法此法是向混合物水溶液中加入易溶于水的無機(jī)鹽至一定濃度或成飽和狀態(tài)，使某些中藥成分在水中溶解度降低而析出，達(dá)到與其他雜質(zhì)分離的目的。常用于鹽析的無機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。四、結(jié)晶法從非結(jié)晶狀物質(zhì)通過處理得到結(jié)晶狀物質(zhì)的過程稱為結(jié)晶。用反復(fù)結(jié)晶的方法，從不純的結(jié)晶制得較純結(jié)晶的過程稱為重結(jié)晶。結(jié)晶法往往用于固體物質(zhì)的精制純化，是利用混合物中各成分對某種溶劑溶解度的差別，使單一成分以結(jié)晶狀態(tài)析出，從而達(dá)到分離目的。（二）結(jié)晶溶劑的選擇結(jié)晶法的關(guān)鍵是選擇適宜的溶劑。恰當(dāng)?shù)娜軇┮话銘?yīng)符合下列條件：1．溶解度對欲結(jié)晶成分熱時(shí)溶解度大，冷時(shí)溶解度小；而對雜質(zhì)則冷、熱均溶或均不溶。2．與被結(jié)晶的成分不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。3．沸點(diǎn)溶劑的沸點(diǎn)適中，若沸點(diǎn)過高，則附著于晶體表面不易除去，過低又不利于晶體析出。常用于結(jié)晶的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、醋酸、吡啶等。當(dāng)用單一溶劑不能達(dá)到結(jié)晶時(shí)，可用兩種或兩種以上溶劑組成的混合溶劑進(jìn)行結(jié)晶操作。常用的混合溶劑有：水-乙醇、水-丙酮、乙醇-乙醚、乙醇-氯仿、乙醇-醋酸乙酯-乙醚等。（三）結(jié)晶純度的判斷1．晶形和色澤結(jié)晶性純凈物質(zhì)，一般具有一定的晶形和均勻的色澤?；衔锝Y(jié)晶的形狀往往因所用溶劑不同而有差異。2．熔點(diǎn)和熔距單體化合物還應(yīng)有一定的熔點(diǎn)和較小的熔距。如為純凈的化合物，重結(jié)晶前后的熔點(diǎn)應(yīng)該一致。五、透析法透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析膜，而大分子物質(zhì)不能通過透析膜的性質(zhì)達(dá)到分離的方法（圖2-9）。透析法分離效果的關(guān)鍵是根據(jù)欲分離成分的具體情況選用規(guī)格適宜的透析膜。透析膜有動物性膜、火棉膠膜、羊皮紙膜（硫酸紙膜）、蛋白膠膜、玻璃紙膜等。透析法分離量較小，時(shí)間長，一般在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較多。七、色譜法色譜法（chromatography）又稱層析法，是一種分離和鑒定化合物的有效方法，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于分離效能高、快速簡便。對一些結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似化合物的分離，用經(jīng)典的萃取法、沉淀法和結(jié)晶法等難以達(dá)到分離目的時(shí)，用色譜法往往可以收到很好的分離效果。

色譜法根據(jù)分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜與離子交換色譜等；根據(jù)分離方法又可分為：

薄層色譜法（thinlayerchromatography，TLC）柱色譜法（columnchromatography）紙色譜法（paperchromatography，PC）高效液相色譜法和氣相色譜法等

（一）吸附色譜法1．基本原理2．常用吸附劑（1）硅膠（2）氧化鋁

硅膠和氧化鋁含水量越高、活性級別越大，吸附活性越弱。

只要在110℃左右加熱，這些“自由水”

就能被可逆性地除去。利用這一原理可以對吸附劑進(jìn)行活化（去水）和脫活化（加水）處理，以控制吸附劑的活性。

硅膠、氧化鋁的含水量與活性級別活性級別硅膠含水量%氧化鋁含水量%Ⅰ00Ⅱ53Ⅲ156Ⅳ2510Ⅴ3815（3）聚酰胺（4）活性炭1）粉末狀活性炭2）顆粒狀活性炭3）錦綸活性炭3．展開劑化合物被吸附劑吸附后，需用合適的溶劑進(jìn)行展開，這種溶劑稱為展開劑，在柱色譜中習(xí)慣稱為洗脫劑。展開劑在吸附色譜中主要作用是解吸附。在吸附色譜中，展開劑的展開能力與其極性有關(guān)。對于極性吸附劑，展開劑的極性越大，其展開能力越強(qiáng)，化合物在色譜中移動的速度就越快，而對非極性吸附劑則相反，展開劑的極性越小，其展開能力越強(qiáng)。4．被分離成分被分離成分與吸附劑、展開劑共同構(gòu)成了吸附色譜中的三要素。對硅膠、氧化鋁等極性吸附劑來說，對極性大的化合物吸附強(qiáng)，移動慢，Rf值小；而對極性小的化合物吸附弱，Rf值大，從而將各成分分離開。全面考慮吸附劑、展開劑和被分離成分三者的相互關(guān)系，是分離成敗的關(guān)鍵。5．操作方式吸附色譜常見的操作方式是薄層色譜和柱色譜。薄層色譜主要用于化學(xué)成分的預(yù)試、鑒定及探索柱色譜分離的條件，柱色譜主要用于化學(xué)成分的分離制備及含量測定。（1）吸附薄層色譜法此法是將吸附劑均勻地鋪在玻璃板上形成薄層，把欲分離的試樣溶液點(diǎn)加到薄層板的一端，然后用合適的展開劑展開，使混合物中各成分得以分離的方法。吸附薄層色譜的操作主要包括鋪板（制板）、點(diǎn)樣、展開和顯色四個(gè)方面。實(shí)際工作中常用硅膠-羧甲基纖維素鈉（硅膠CMC-Na）薄層板，展開方式有上行法、下行法、單向展開、雙向展開等多種。將計(jì)算出的Rf值與已知化合物的Rf值對照，也可與文獻(xiàn)上記載的Rf值比較，進(jìn)行定性鑒別。薄層色譜廣泛應(yīng)用于植物各類化學(xué)成分的分離鑒定，也可應(yīng)用于中草藥品種、藥材及其制劑真?zhèn)蔚臋z查、質(zhì)量控制和資源調(diào)查?！端幍洹芬徊坎捎帽由V法作鑒別的中藥材和中藥成方制劑品種已達(dá)1523種（2）吸附柱色譜法吸附柱色譜法是將試樣加入到一定規(guī)格裝有吸附劑的玻璃柱里，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?，使結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同的成分達(dá)到分離的方法。其分離原理、吸附劑和洗脫劑的選擇均與吸附薄層色譜法基本相同。柱色譜的具體操作可分為裝柱、加樣和洗脫三步。（二）分配色譜法分配色譜法是一種利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的不同，進(jìn)行分離的色譜方法。1．基本原理1．基本原理分配色譜的原理來自于兩相溶劑萃取法。2．載體載體又稱支持劑、擔(dān)體，在分配色譜中只起支持固定相的作用，對被分離成分無吸附作用，而且作為分配色譜的載體均為中性多孔粉末，不溶于兩相溶劑中，也不與被分離成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。3．固定相、流動相與被分離成分據(jù)固定相與流動相的極性差別，分配色譜有正相與反相色譜法之分。在正相分配色譜法中，流動相的極性小于固定相極性，而在反相分配色譜法中，流動相的極性則大于固定相的極性。

反相分配色譜法應(yīng)用廣泛，其常用的固定相是在普通硅膠表面進(jìn)行化學(xué)修飾，鍵合上長度不同的烴基（R）形成親脂性表面，習(xí)稱鍵合相，如十八烷基或辛基硅烷鍵合相。4．操作方式（1）紙色譜法（2）分配薄層色譜法（3）分配柱色譜法（三）高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）

此法是在經(jīng)典的液相色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速分離分析新技術(shù)。是采用了高效填充劑，利用加壓手段加快流動相流速的一種高效能液相色譜法。按分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜及凝膠色譜等，其中液－液分配色譜應(yīng)用最廣泛，根據(jù)其固定相與流動相極性的差別，亦分為正相分配色譜和反相分配色譜兩類。正相色譜主要用于極性物質(zhì)的分離測定；反相色譜主要用于非極性、中等極性物質(zhì)的分離測定。高效液相色譜儀由輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理器等組成（圖2-11）。

羥基喜樹堿（Ⅰ）R1=R2=OH喜樹堿（Ⅱ）R1=OH，R2=H10-甲氧基喜樹堿（Ⅲ）R1=OH，R2=OCH3脫氧喜樹堿（Ⅳ）R1=R2=H高效液相色譜法分離速度快、效率高、試樣分析重現(xiàn)性好，而且試樣不需氣化