基因編輯技術和原理

基因編輯技術和原理第1頁/共23頁

什么是基因編輯技術？

基因編輯是指對基因組進行定點修飾的一項新技術。利用該技術，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上剪斷靶標DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達成了“編輯基因”。第2頁/共23頁

基因編輯的研究背景

傳統(tǒng)的動物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費大量的人力、物力和財力，經(jīng)歷漫長的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進展。第3頁/共23頁基因編輯原理

現(xiàn)代基因組編輯技術的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂激活細胞天然的修復機制，包括非同源末端連接和同源重組修復兩條途徑。第4頁/共23頁

1.非同源末端連接（NHEJ）是一種低保真度的修復過程，斷裂的DNA修復重連的過程中會發(fā)生堿基隨機的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實現(xiàn)目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ機制會將其連入雙鏈斷裂DSB位點，從而實現(xiàn)定點的基因敲入。

（

移碼突變：在正常DNA分子中，堿基缺失或增加3的倍數(shù)，造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。）第5頁/共23頁

2.同源重組修復（HR）是一種相對高保真度的修復過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點，不會出現(xiàn)隨機的堿基插入或丟失。如果在一個基因兩側同時產(chǎn)生DSB，在一個同源供體存在的情況下，可以進行原基因的替換。第6頁/共23頁

基因編輯原理第7頁/共23頁基因編輯技術的種類目前主要有3種基因編輯技術，分別為：人工核酸酶介導的鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN)技術；轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技術；RNA引導的CRISPR-Cas核酸酶技術(CRISPR-Cas9）。第8頁/共23頁

1.ZFN基因組編輯技術ZFN技術是第一代基因組編輯技術，其功能的實現(xiàn)是基于具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年Diakun等首先在真核生物轉錄因子家族的DNA結合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2-His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN可識別24bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應用。第9頁/共23頁ZFN由鋅指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸內切酶組成。其中，由ZFP構成的DNA識別域能識別特異位點并與之結合，而由FokⅠ構成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結合可使靶位點的雙鏈DNA斷裂(DSB)。于是，細胞可以通過同源重組(HR)修復機制和非同源末端連接(NHEJ)修復機制來修復DNA。HR修復有可能會對靶標位點進行恢復修飾或者插入修飾，而NHEJ修復極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達到基因敲除的目的。第10頁/共23頁ZFN誘導的基因組編輯技術可應用于很多物種及基因位點，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?個方面的缺陷制約了該技術的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設計高親和性的ZFN，需要投入大量的工作和時間;(2)在細胞中持續(xù)表達ZFN對細胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設計具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應。第11頁/共23頁

2.TALEN基因組編輯技術

2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉錄激活子樣效應因子，它的蛋白核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有較恒定的對應關系。隨后，TALE特異識別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術中的鋅指蛋白。它可設計性更強，不受上下游序列影響，具備比ZFN更廣闊的應用潛力。第12頁/共23頁TALENs包含兩個TALEN蛋白,每個TALEN都是由TALEarray與FokⅠ融合而成.其中一個TALEN靶向正義鏈上靶標位點,另一個則靶向反義鏈上的靶標位點.然后FokⅠ形成二聚體,在靶向序列中間的spacer處切割DNA,造成雙鏈DNA斷裂,隨后細胞啟動DNA損傷修復機制.針對不同的TALEN骨架,其最適宜的spacer長度不同,其長度范圍一般為12~20bp.實驗結果表明,TALENs在靶向DNA時,第一個堿基為T時其結合效果更佳。第13頁/共23頁目前，TALEN已經(jīng)成功應用于酵母、哺乳動物和植物的位點特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應用優(yōu)勢，但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應、TALEN與基因組進行特異結合與染色體位置及鄰近序列有關等。3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術第14頁/共23頁1987年，Ishino等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復序列廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復序列與細菌獲得性免疫的關系。第15頁/共23頁CRISPR/Cas系統(tǒng)由Cas9核酸內切酶與sgRNA構成.轉錄的sgRNA折疊成特定的三維結構后與Cas9蛋白形成復合體,指導Cas9核酸內切酶識別特定靶標位點,在PAM序列上游處切割DNA造成雙鏈DNA斷裂,并啟動DNA損傷修復機制.從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng),其CrRNA(或者是人工構建的sgRNA)靶向序列的長度不同,PAM序列也可能不同。第16頁/共23頁在這個系統(tǒng)中，只憑借一段RNA便能識別外來基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012年，Jinek等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導的DNA核酸內切酶，標志著CRISPR/Cas9基因組編輯技術成功問世。第17頁/共23頁

三種不同技術的比較第18頁/共23頁第19頁/共23頁基因編輯的優(yōu)勢與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細胞技術為基礎的基因打靶技術相比，基因編輯新技術保留了可