南農(nóng)生物技術(shù)制藥基因工程藥物

南農(nóng)生物技術(shù)制藥基因工程藥物第1頁(yè)/共213頁(yè)Sometherapeuticproductsforusedinhumans第2頁(yè)/共213頁(yè)Genentech公司1976年，27歲的風(fēng)險(xiǎn)投資人RobertSwanson與UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術(shù)的商業(yè)前景。討論結(jié)束時(shí)，他們決定建立一個(gè)公司，并取名為Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一個(gè)基因工程公司在學(xué)術(shù)界和商業(yè)界的滿腹懷疑中誕生了！第3頁(yè)/共213頁(yè)Genentech的驕人業(yè)績(jī)1976Genentech創(chuàng)立1977首次在微生物里生產(chǎn)了人蛋白生長(zhǎng)激素抑制素1978克隆了人胰島素基因1979克隆了人生長(zhǎng)激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一個(gè)基因重組藥（人胰島素）上市（轉(zhuǎn)讓給Lilly公司）1984第一個(gè)VIII因子，轉(zhuǎn)讓給CutterBiological1985第一個(gè)自己生產(chǎn)的產(chǎn)品（人生長(zhǎng)激素）1987生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑（tPA）1990生產(chǎn)interferon1

1990與瑞士Roche醫(yī)藥公司合并（$2.1billion）第4頁(yè)/共213頁(yè)美國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1997.7）中文名稱商品名稱英文名縮寫開(kāi)發(fā)公司胰島素Humulin

Novolin

HumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生長(zhǎng)激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干擾素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogen

ChironGenentechInterferonScience第5頁(yè)/共213頁(yè)白細(xì)胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒細(xì)胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex紅細(xì)胞生成素EpogenProcritrhuEPO

AmgenOrtho組織溶纖原激活劑ActivaserhuTPAGenentech生長(zhǎng)激素SerostinsomatotropinSerono促生長(zhǎng)素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSerono

Pharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral第6頁(yè)/共213頁(yè)抗血友病因子VIIIKogenate

RecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄腦苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脫氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline第7頁(yè)/共213頁(yè)體內(nèi)用單克隆抗體Reopro

OrthoOKT-3Onco

ScintCR/OVOnco

ScintOC103Onco

ScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocor

OrthoBiotechCytogen

Cytogen

Cytogen

Cytogen鼠單克隆抗體PanorexMurineMABGlaxoWelcome1第8頁(yè)/共213頁(yè)中國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1998.5）藥品名縮寫開(kāi)發(fā)生產(chǎn)公司批準(zhǔn)時(shí)間適應(yīng)癥rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a長(zhǎng)春生研所上海生研所深圳興科長(zhǎng)春生研所長(zhǎng)生藥業(yè)三生藥業(yè)1989試1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖銳濕疣，皰疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲藥業(yè)里亞哈爾華立達(dá)安科華新1997正1996正1997正1997試1997試HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCV第9頁(yè)/共213頁(yè)rhuINF

上海生研所克隆麗珠生物工程1994試1995試1995試類風(fēng)濕類風(fēng)濕類風(fēng)濕rhuIL2長(zhǎng)春生研所長(zhǎng)春藥業(yè)四環(huán)制藥華新三生藥業(yè)深圳興科中華合通金絲利康利制藥1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995試1995試1995試癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療第10頁(yè)/共213頁(yè)rhuG-CSF九源1997試化療生白血病rhuGM-CSF特寶1997試化療生白血病rSK醫(yī)大實(shí)業(yè)1996試心梗溶栓rhuEPO華欣永銘維沃1997試1997試再生障礙性貧血再生障礙性貧血bFGF（外用）珠海東大1996試創(chuàng)傷，燒傷第11頁(yè)/共213頁(yè)一、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生1、生產(chǎn)基因工程藥品

（1）傳統(tǒng)的某些藥品（如動(dòng)物激素）生產(chǎn)：控制某種物質(zhì)合成基因轉(zhuǎn)基因“工程菌”基因工程藥品基因表達(dá)產(chǎn)物基因工程發(fā)酵分離提取從動(dòng)物組織中提取，生產(chǎn)量小，價(jià)格昂貴。（3）基因工程生產(chǎn)的藥品重組人生長(zhǎng)激素重組人白細(xì)胞介素重組人干擾素重組人胰島素發(fā)酵罐（2）基因工程方法生產(chǎn)藥品的方法：第12頁(yè)/共213頁(yè)13第13頁(yè)/共213頁(yè)二、基因工程菌大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成三常用的大腸桿菌表達(dá)載體四真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)五大腸桿菌表達(dá)真核基因存在的問(wèn)題六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制七.人胰島素的生產(chǎn)方法第14頁(yè)/共213頁(yè)一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序,共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素(endotoxin)periplasmheterogous第15頁(yè)/共213頁(yè)二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成一個(gè)良好的大腸桿菌表達(dá)載體：有抗菌素抗性基因決定載體拷貝數(shù)的復(fù)制起點(diǎn)(ori)供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)。參與控制轉(zhuǎn)錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細(xì)胞中表達(dá),它的編碼結(jié)構(gòu)必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動(dòng)子有效控制下。第16頁(yè)/共213頁(yè)1啟動(dòng)子可使外源基因高水平表達(dá)的最佳啟動(dòng)子必須具備以下幾個(gè)條件1)強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上2)應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3)應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式,使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)。Accountforinducible第17頁(yè)/共213頁(yè)b:如果在啟動(dòng)子的上游部位放置一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那么由該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的克隆基因的轉(zhuǎn)錄便會(huì)被限制在最低本底水平。2終止子

a

:如果在克隆基因編碼區(qū)的3末端之后，接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀過(guò)位于下游另一個(gè)啟動(dòng)子

c:轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平。第18頁(yè)/共213頁(yè)在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。大腸桿菌格外偏愛(ài)使用終止密碼子UAA,當(dāng)其后連上一個(gè)U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止效率便會(huì)得到進(jìn)一步加強(qiáng)。第19頁(yè)/共213頁(yè)3轉(zhuǎn)譯起始序列mRNA的5末端之獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,是決定mRNA轉(zhuǎn)譯起始效率的主要因素。在構(gòu)建外源基因的高效表達(dá)載體時(shí),需認(rèn)真選擇有效的轉(zhuǎn)錄起始序列。未鑒定出通用有效的轉(zhuǎn)譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)initiationfactorconservedsequenceuniversial第20頁(yè)/共213頁(yè)4、reportergene其編碼產(chǎn)物可被快速測(cè)定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結(jié)構(gòu)(重組質(zhì)粒)是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞同任何一種目的啟動(dòng)子連接,其表達(dá)活性可作為檢測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)。usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ、堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)alkalinephosphatase第21頁(yè)/共213頁(yè)三常用的大腸桿菌表達(dá)載體啟動(dòng)子廣泛使用的大多數(shù)質(zhì)粒表達(dá)載體啟動(dòng)子λ噬菌體的PL啟動(dòng)子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動(dòng)子色氨酸操縱子trp啟動(dòng)子pBR322質(zhì)粒的beta－內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子LactoseOperon第22頁(yè)/共213頁(yè)圖1-1在大腸桿菌中基因表達(dá)的3個(gè)重要信號(hào)啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)基因終止子DNARNA轉(zhuǎn)錄核糖體結(jié)合mRNA位點(diǎn)第23頁(yè)/共213頁(yè)圖1-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列的比較TTGACATATAATPu>Py-35區(qū)-30-70正調(diào)控區(qū)-20負(fù)調(diào)控區(qū)+1-10區(qū)GC區(qū)….CAAT區(qū)TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增強(qiáng)子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核第24頁(yè)/共213頁(yè)圖1-3通過(guò)表達(dá)載體在大腸桿菌中被表達(dá)PRTTPRTPRmRNA蛋白質(zhì)表達(dá)載體外源基因?qū)⑼庠椿虿迦胂拗菩悦盖形稽c(diǎn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌第25頁(yè)/共213頁(yè)圖1-4雜交基因的構(gòu)建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正確融合N端C端不正確融合外源基因不被翻譯表達(dá)ATATTA

GGAGCTGGAGC融合蛋白親和層析法純化化學(xué)試劑除去大腸桿菌肽段第26頁(yè)/共213頁(yè)圖1-5在大腸桿菌中表達(dá)外源基因長(zhǎng)遇到的問(wèn)題翻譯轉(zhuǎn)錄PRTT轉(zhuǎn)錄大腸桿菌不能切除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄提前終止第27頁(yè)/共213頁(yè)圖1-6真核細(xì)胞表達(dá)載體常用的4種啟動(dòng)子P半乳糖轉(zhuǎn)錄GAL10P甲醇轉(zhuǎn)錄乙醇氧化酶基因（a）GAL啟動(dòng)子（b）AOX啟動(dòng)子（c）葡萄糖水解酶啟動(dòng)子（d）纖維二糖水解酶啟動(dòng)子P纖維素轉(zhuǎn)錄纖維素二糖水解酶基因P淀粉轉(zhuǎn)錄葡萄糖淀粉酶基因木糖不轉(zhuǎn)錄第28頁(yè)/共213頁(yè)四真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)三種表達(dá)部位各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)//

而且對(duì)克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的制備有很大關(guān)系。在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)在細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)以分泌到細(xì)胞外的形式表達(dá)。1外源基因在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)位置cytoplasmperiplasm第29頁(yè)/共213頁(yè)1)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)expressedincytoplasm包含體是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)。在表達(dá)中應(yīng)盡可能限制包含體產(chǎn)生,并促進(jìn)形成天然三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。多采用與分子伴侶共表達(dá)的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折疊能力的一種有效途徑。insolublechaperon第30頁(yè)/共213頁(yè)周質(zhì):指大腸桿菌一類G-菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在大腸桿菌中,已成功的使用了各種不同類型信號(hào)肽,將細(xì)胞質(zhì)中蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)。周質(zhì)中表達(dá)外源蛋白質(zhì)優(yōu)點(diǎn):A:周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類少,周質(zhì)中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)能夠被有效的濃縮和純化。b:周質(zhì)氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)按正確的方式折疊c:在周質(zhì)中蛋白質(zhì)降解不廣泛。來(lái)自原核、真核的外源基因都成功的在大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中實(shí)現(xiàn)了有效表達(dá)。2)周質(zhì)中表達(dá)expressedin

periplasm第31頁(yè)/共213頁(yè)3)分泌表達(dá)使在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化,這種研究思路稱為外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。第32頁(yè)/共213頁(yè)目的蛋白穩(wěn)定性高:目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整將外源基因與大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列重組在一起進(jìn)行分泌表達(dá),其N端的甲硫氨酸殘基可在信號(hào)肽剪切過(guò)程中被有效除去這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí),蛋白質(zhì)甲硫氨酸殘基往往不能被切除。分泌表達(dá)優(yōu)點(diǎn)

:重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周質(zhì)中,其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍許多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸殘基。intactexcise第33頁(yè)/共213頁(yè)外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá);外源基因分泌表達(dá)的表達(dá)率通常要比包涵體形式低很多分泌表達(dá)缺點(diǎn)相對(duì)其它生物細(xì)胞,大腸桿菌蛋白分泌機(jī)制不健全。目前產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌工程菌很少Perfectsound第34頁(yè)/共213頁(yè)分泌型重組蛋白具有較高比例正確構(gòu)象，對(duì)蛋白酶不敏感蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)胞周質(zhì)中有多種分子伴侶,可阻止分泌蛋白隨機(jī)折疊分泌至細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中重組蛋白很少形成分子間二硫鍵與包涵體相比randomSulferinnerouter第35頁(yè)/共213頁(yè)重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建有些G-能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中,這一過(guò)程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白

,它激活定位于內(nèi)膜上的磷酸酯酶,導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞完全分泌型受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化permeabilitybacteriocin第36頁(yè)/共213頁(yè)二種類型由報(bào)告基因編碼序列和另一個(gè)基因啟動(dòng)子及其它的調(diào)節(jié)序列構(gòu)成。用于研究啟動(dòng)子功能及調(diào)控作用分子機(jī)理。由一種異源蛋白質(zhì)基因編碼序列同寄主細(xì)胞誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成。用于生產(chǎn)新型融和蛋白。2融和蛋白質(zhì)表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起,并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。

2.1融和基因第37頁(yè)/共213頁(yè)attention外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因2.2融和蛋白的表達(dá)策略融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá),且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要,它直接決定融合蛋白的裂解。兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架在DNA水平上，人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn),可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白Baseonconsistent第38頁(yè)/共213頁(yè)使克隆外源基因有效轉(zhuǎn)譯有效轉(zhuǎn)譯：取決于核糖體的結(jié)合位點(diǎn),

受到編碼區(qū)起點(diǎn)核苷酸序列影響?？墒沟鞍踪|(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定,免受寄主胞內(nèi)酶的降解作用,因此可以得到較高的產(chǎn)率?？赡軜?gòu)成一種信號(hào)肽指導(dǎo)大腸桿菌蛋白質(zhì)分配到細(xì)胞的正確位置。能夠使用親和層析技術(shù)分離純化融合蛋白。2.3表達(dá)融合蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)ribosome第39頁(yè)/共213頁(yè)3整合型異源蛋白的表達(dá)工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下,可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒,

這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程特別有意義3.1整合形式表達(dá)目的蛋白的特點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)目的基因表達(dá)率低整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA一起復(fù)制,

在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制,此時(shí)可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件加以補(bǔ)償replicate/stabilitySpecies/improvementintensify第40頁(yè)/共213頁(yè)轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組同源序列依賴型的體內(nèi)重組3.2DNA體內(nèi)重組的基本原理第41頁(yè)/共213頁(yè)生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無(wú)復(fù)制能力的DNA可移動(dòng)因子,不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子噬菌體G片段(G-Fragment)原核微生物插入順序(IS)真核微生物轉(zhuǎn)座子(Tn、Ty)高等植物可移動(dòng)因子(Ac、Ds)高等動(dòng)物跳躍基因(mobilegene)轉(zhuǎn)位因子transposon轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組第42頁(yè)/共213頁(yè)轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)transposonpalindromerepressorinversionregion第43頁(yè)/共213頁(yè)整合形式第44頁(yè)/共213頁(yè)

同源整合同源序列依賴型的體內(nèi)重組同源整合一般地說(shuō),距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高,重組的頻率也就越高,反之亦然。同源整合第45頁(yè)/共213頁(yè)1基因結(jié)構(gòu)存在很大差異。大多數(shù)真核基因含有內(nèi)含子，細(xì)菌細(xì)胞中沒(méi)有除去內(nèi)含子機(jī)制；五大腸桿菌表達(dá)真核基因存在的問(wèn)題2轉(zhuǎn)錄信號(hào)不同。真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子不具有結(jié)合細(xì)菌核糖體所必須的SD序列。細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核生物啟動(dòng)子3mRNA的分子結(jié)構(gòu)有所差異。絕大多數(shù)真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一個(gè)帽結(jié)構(gòu)。影響mRNA在細(xì)菌中的穩(wěn)定性及與細(xì)菌核糖體相結(jié)合的能力，阻止正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯。4真核生物的蛋白質(zhì)有些是通過(guò)前體分子加工來(lái)的。在細(xì)菌中不存在這種修飾作用。5細(xì)菌的蛋白酶可以識(shí)別和降解真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物第46頁(yè)/共213頁(yè)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制1工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)形式基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)性,具有下列兩種表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸segregativeinstabilitydomainDeletionregionrearrange第47頁(yè)/共213頁(yè)受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解2工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排Deletion第48頁(yè)/共213頁(yè)以構(gòu)建穩(wěn)定性高質(zhì)粒:

將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)型載體中:其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞3改進(jìn)載體、受體系統(tǒng)正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn):禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上，并構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)。

eg:大腸桿菌的ssb基因(DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因)第49頁(yè)/共213頁(yè)根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素(藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素)4施加選擇壓力根據(jù)載體上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記,向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)組份(培養(yǎng)基復(fù)雜,成本較高)correspond第50頁(yè)/共213頁(yè)使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度5控制目的基因過(guò)量表達(dá)使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)(優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝)培養(yǎng)基組成:限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度:較低培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定replicon第51頁(yè)/共213頁(yè)1982年,美國(guó)ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司,成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。七.人胰島素的生產(chǎn)方法基因工程法生產(chǎn)人胰島素體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒(méi)有任何區(qū)別具有無(wú)免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。potentialimmunogenic第52頁(yè)/共213頁(yè)SHSHSHSHCCCC

COO_SHSHN

CCS.S.Pre-pro-insulinSSSSCCCC

COO_SSCCS-SPro-insulinNSSSSCCCCCOO_CCS

SS-SinsulinN第53頁(yè)/共213頁(yè)基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列表達(dá)重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達(dá)法1synthesis第54頁(yè)/共213頁(yè)第55頁(yè)/共213頁(yè)由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對(duì)率較低,通常只有10%-20%.采用這條工藝路線生產(chǎn)正確配對(duì)率較低,采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)100美元以上。A鏈和B鏈分別表達(dá)法生產(chǎn)技術(shù)評(píng)價(jià)為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本,美國(guó)ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線第56頁(yè)/共213頁(yè)基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略

人胰島素原表達(dá)法proinsulin第57頁(yè)/共213頁(yè)表達(dá)產(chǎn)物后處理路線B鏈中第22位上的Arg和第29位上的Lys,由于良好折疊的原因,對(duì)胰蛋白酶不敏感第58頁(yè)/共213頁(yè)在人胰島素原表達(dá)工藝中,由于C肽的存在,胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象,三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)率也相應(yīng)提高,折疊率高達(dá)80%以上。生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)目前美國(guó)ElyLiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。雖然這條工藝路線不比AB鏈分別表達(dá)法更為簡(jiǎn)捷,而且還要使用兩種高純度的酶制劑,但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷,使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。第59頁(yè)/共213頁(yè)第60頁(yè)/共213頁(yè)

一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與beta-內(nèi)酰胺酶基因拼接,beta-內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性,為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。分泌型重組人胰島素表達(dá)法上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌beta-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng),但不能分泌,只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。第61頁(yè)/共213頁(yè)什么叫蛋白質(zhì)工程指通過(guò)改造與蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因中的堿基順序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆至受體細(xì)胞中，通過(guò)基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)（酶）技術(shù)。這是一門從改變基因入手，定做新的蛋白質(zhì)的技術(shù)。故有人將其稱為“第二代基因工程”

1983年，美國(guó)生物學(xué)家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。蛋白質(zhì)工程和基因工程蛋白質(zhì)類藥物第62頁(yè)/共213頁(yè)

1、蛋白質(zhì)工程的理論設(shè)計(jì)：包括活性設(shè)計(jì)、專一性設(shè)計(jì)、框架（構(gòu)象）設(shè)計(jì)等。由于對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)還不系統(tǒng)，目前的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)僅僅是對(duì)天然蛋白質(zhì)的修飾。如：異常血紅蛋白的氨基酸取代去羧基端胰島素等。

蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；從氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新蛋白質(zhì)。

第63頁(yè)/共213頁(yè)2、基因修飾——點(diǎn)突變法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變通過(guò)基因修飾來(lái)完成基因修飾的方法：⑴基因的全化學(xué)合成按照所需蛋白質(zhì)的氨基酸順序，先后合成結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄的起始信號(hào)及終止信號(hào)、限制酶切位點(diǎn)等核酸片段，然后用連接酶將各片段連接起來(lái)，通過(guò)基因工程轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。目前用此法已合成了：人血細(xì)胞干擾素、胰島素、生長(zhǎng)激素釋放抑制激素等基因。

第64頁(yè)/共213頁(yè)調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)基因結(jié)構(gòu)基因終止基因連接酶完整基因第65頁(yè)/共213頁(yè)⑵基因直接修飾法將連接于質(zhì)粒上的某一蛋白質(zhì)的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，從而獲得新的突變體。已修飾過(guò)的酶有：內(nèi)酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氫葉酸還原酶等酶蛋白。第66頁(yè)/共213頁(yè)限制性內(nèi)切酶外源DNA限制性內(nèi)切酶退火重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選表達(dá)帶重組體的細(xì)胞目的產(chǎn)物質(zhì)粒目的基因酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質(zhì)粒第67頁(yè)/共213頁(yè)⑶盒式突變

1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)，一次可以在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對(duì)蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析。蛋白質(zhì)工程的運(yùn)用蛋白質(zhì)或肽類藥物的改造和新藥的研制

第68頁(yè)/共213頁(yè)酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質(zhì)粒同時(shí)獲得多個(gè)突變體第69頁(yè)/共213頁(yè)圖3-1胰島素的分子結(jié)構(gòu)和從前胰島素原合成胰島素的簡(jiǎn)要過(guò)程30個(gè)氨基酸B鏈21個(gè)氨基酸A鏈胰島素利于重組生產(chǎn)的特點(diǎn)前導(dǎo)序列BCA前胰島素原（胰島素原=BCA——無(wú)前導(dǎo)序列）胰島素∣S∣S∣∣S∣S∣BA剪切-S-S--S-S-LBAC自發(fā)折疊蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用第70頁(yè)/共213頁(yè)圖3-2由人工合成的A,B鏈的基因合成重組胰島素lac啟動(dòng)子lacZ’A基因運(yùn)載人工合成的A基因的載體B基因運(yùn)載人工合成的B基因的載體(a)人工合成的基因(b)合成胰島素蛋白ABmetβ-半乳糖苷酶片段A鏈胰島素純化A鏈和B鏈二硫鍵連接metB鏈溴化氰處理pBR322pBR322轉(zhuǎn)化的大腸桿菌合成AB融合蛋白第71頁(yè)/共213頁(yè)圖3-3重組促生長(zhǎng)素抑制素的合成lac啟動(dòng)子lacZ’人工促生長(zhǎng)素抑制素基因metβ-半乳糖苷酶片段促生長(zhǎng)素抑制素融合蛋白轉(zhuǎn)化大腸桿菌促生長(zhǎng)素抑制素（14氨基酸）溴化氰第72頁(yè)/共213頁(yè)圖3-4重組生長(zhǎng)素的合成密碼子01911912424024HaeⅢ保留除去（a）生長(zhǎng)素cDNA片段的準(zhǔn)備過(guò)程（b）表達(dá)024合成前導(dǎo)序列191cDNAlac啟動(dòng)子插入表達(dá)載體合成生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)化大腸桿菌第73頁(yè)/共213頁(yè)圖3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻譯產(chǎn)物外顯子（26）內(nèi)含子（25）（a）凝血因子Ⅷ基因（b）凝血因子Ⅷ的翻譯后的加工初級(jí)翻譯產(chǎn)物（2351個(gè)氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子Ⅷ蛋白加工第74頁(yè)/共213頁(yè)重組凝血因子Ⅷ合成的幾種方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成（倉(cāng)鼠細(xì)胞）利用活體動(dòng)物生產(chǎn)（豬）利用表達(dá)載體Ag啟動(dòng)子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子Ⅷ的cDNA導(dǎo)入倉(cāng)鼠細(xì)胞重組蛋白第75頁(yè)/共213頁(yè)干擾素的合成干擾素分子結(jié)構(gòu)干擾素生產(chǎn)車間第76頁(yè)/共213頁(yè)圖3-7利用分離的病毒殼體蛋白作疫苗的原理分離的病毒殼體蛋白殼體蛋白的特異抗體注射到血液循環(huán)抗體包圍整個(gè)病毒被完整病毒感染第77頁(yè)/共213頁(yè)圖3-8重組牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒啟動(dòng)子重組牛痘病毒基因組牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗體抗牛痘病毒抗體注射重組牛痘病毒顆粒到血液循環(huán)免疫系統(tǒng)合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗體第78頁(yè)/共213頁(yè)表3-2在重組牛痘病毒中表達(dá)的外源基因

基因惡性瘧原蟲(chóng)表面抗原流行性感冒病毒衣殼蛋白狂犬病病毒G蛋白乙型肝炎主要表面抗原單純皰疹糖蛋白人類免疫缺陷病毒（HIV）表面蛋白水泡性口炎衣殼蛋白仙臺(tái)病毒蛋白BACK第79頁(yè)/共213頁(yè)80（inclusionbodiesIBs)基因工程包含體的純化基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理胞外分泌型表達(dá)：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心，收集上清→純化胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標(biāo)蛋白變性溶解→復(fù)性→純化。第80頁(yè)/共213頁(yè)81外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長(zhǎng)激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體第81頁(yè)/共213頁(yè)82包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)正常代謝水平，過(guò)多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀；②蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀；④表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)⑤蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。包含體的構(gòu)成第82頁(yè)/共213頁(yè)83基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。第83頁(yè)/共213頁(yè)841）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來(lái)困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。第84頁(yè)/共213頁(yè)85

2）目標(biāo)蛋白的變性溶解

包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。常用變性劑：▲

5-8mol/L鹽酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破壞離子間相互作用；▲

表面活性劑如1-2％SDS，作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用?！?/p>

PH>9.0的堿溶液和有機(jī)溶劑，使用較少。影響變性因素：時(shí)間、pH、離子強(qiáng)度、變性劑種類和濃度。第85頁(yè)/共213頁(yè)86原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵沒(méi)有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會(huì)重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過(guò)程稱復(fù)性。復(fù)性方法：稀釋法除變性劑－加入大量水或緩沖液。膜分離法除變性劑－透析、超濾、電滲析。層析法：凝膠層析，高效疏水層析3）目標(biāo)蛋白的復(fù)性第86頁(yè)/共213頁(yè)87

蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素：變性劑濃度目標(biāo)蛋白濃度；pH和離子強(qiáng)度；氧化還原條件。

還原劑：

二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽；氧化劑：氧化型谷胱甘肽;堿性下通空氣。

復(fù)性區(qū)

多聚物生成區(qū)

絮凝沉淀區(qū)鹽酸胍濃度mol/L紅血球碳酐酶復(fù)性操作中變性劑與蛋白質(zhì)濃度對(duì)復(fù)性的影響蛋白質(zhì)濃度mol/L第87頁(yè)/共213頁(yè)88腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白在E.coli中的高密度發(fā)酵過(guò)程中以兩種形式表達(dá)：◆細(xì)胞內(nèi)有活性的可溶性蛋白形式（約占目標(biāo)蛋白的30%）◆無(wú)活性的包涵體形式（約占目標(biāo)蛋白的70%）。懸浮破壁PBS洗滌離心硫銨沉淀親和層析陽(yáng)離子交換層析溶解復(fù)性親和層析濕菌體發(fā)酵液干凈菌體上清液包涵體純品活性檢測(cè)破壁液離心離心液洗滌舉例：TRAIL的分離純化第88頁(yè)/共213頁(yè)891.包涵體的洗滌①粗制包涵體用50mM磷酸鹽緩沖液，含150mMNaClpH=7.4(1:3w/v)洗滌2-3次；②用含有1MNaCl的磷酸緩沖液洗滌1次(1:3w/v)，將粘附其表面的大部分蛋白及水溶性雜質(zhì)除去；③用6M尿素及0.5%TritonX-100聯(lián)合洗滌1次(1:3w/v)，去除另一些雜蛋白，這時(shí)得較純包涵體（純度達(dá)80%左右）；④用SDS電泳檢測(cè)純度。2.包涵體的變性溶解①洗滌后包涵體用含有30mMDTT及5mol/l鹽酸胍的Tris緩沖液pH=8.0(1:5w/v)變性溶解→室溫?cái)嚢?h，95%以上的包涵體可被溶解；②離心，13000rpm，20min→棄沉淀得到溶解液。第89頁(yè)/共213頁(yè)903.包涵體復(fù)性（間歇式流加稀釋復(fù)性法）以含DTT和ZnSO4的Tris-HCl為復(fù)性緩沖液，再添加0.4ML-Arg，0.5M尿素，0.5MNaCl作為蛋白聚集抑制劑，變性溶解液可多次流加，每次流加的時(shí)間是以上一次流加蛋白已達(dá)到部分復(fù)性為準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中，流加間隔時(shí)間確定為90min，每次流加濃度為150mg/L，變性液流加次數(shù)可高達(dá)6次，最終濃度可達(dá)到1mg/ml，4℃緩慢攪拌一段時(shí)間，對(duì)50mMTris-HCl，300mMNaCl，0.1M尿素及0.2mMZnSO4混合液透析過(guò)夜，透析后離心除去復(fù)性過(guò)程中聚集的蛋白，超濾濃縮（也可用硫酸銨沉淀進(jìn)行濃縮）得復(fù)性蛋白液。第90頁(yè)/共213頁(yè)915.復(fù)性后純化復(fù)性濃縮后蛋白金屬親和層析吸附洗滌：40mmol/L咪唑，洗除非特異性吸附的雜蛋白洗脫：100mmol/L咪唑目標(biāo)蛋白

純度達(dá)95%以上（由SDS和RP-HPLC鑒定）收率75%第91頁(yè)/共213頁(yè)92包含體產(chǎn)物分離工藝（牛生長(zhǎng)激素分離提?。┑?2頁(yè)/共213頁(yè)93

來(lái)自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過(guò)離心除去培養(yǎng)液后加入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復(fù)破碎三次。勻漿經(jīng)過(guò)離心和水洗除去細(xì)胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促進(jìn)劑以除去脂蛋白和未破碎的細(xì)胞。包含體經(jīng)離心沉淀和水洗后進(jìn)行變性溶解，溶解劑為6mol/L鹽酸胍。溶解的同時(shí)通入空氣氧化以打斷錯(cuò)誤連接的雙硫鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質(zhì)的上清液經(jīng)超濾濃縮后過(guò)凝膠柱除去雜蛋白，再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性。復(fù)性過(guò)程中產(chǎn)生的絮凝沉淀用離心除去。包含體產(chǎn)物分離工藝

（牛生長(zhǎng)激素分離提?。┑?3頁(yè)/共213頁(yè)

質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用

第94頁(yè)/共213頁(yè)質(zhì)譜在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定肽質(zhì)量指紋譜肽序列測(cè)定技術(shù)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾鑒定其他蛋白質(zhì)鑒定第95頁(yè)/共213頁(yè)分子量的測(cè)定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS測(cè)定蛋白質(zhì)和多肽的分子量，精確度可達(dá)0.1％～0.01％，這遠(yuǎn)比其它方法(如SDS、凝膠過(guò)濾、超離心等）精確。正確測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，可以提供很多信息，如確定分子大小，從氨基酸組成分析的結(jié)果求得準(zhǔn)確的氨基酸組成，驗(yàn)證已測(cè)定的一級(jí)結(jié)構(gòu)是否正確等。第96頁(yè)/共213頁(yè)分子量測(cè)定實(shí)例采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效凝膠過(guò)濾色譜以及電噴霧離子化質(zhì)譜三種方法對(duì)新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)（來(lái)源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一種具有類凝血酶活性的弱酸性蛋白質(zhì)）的分子量進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)定方法分子量非還原SDS-PAGE26.2kDa(二硫鍵未打開(kāi))還原SDS-PAGE29kDa(二硫鍵被還原)HPGFC24.5kDaESI-MS30298Da第97頁(yè)/共213頁(yè)分子量測(cè)定實(shí)例天花粉蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，在86年時(shí)曾出現(xiàn)差錯(cuò)，當(dāng)時(shí)測(cè)定的結(jié)果表明它是由234個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為25682Da。90年，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)測(cè)定有誤，重新修正了其一級(jí)結(jié)構(gòu)。它應(yīng)由247個(gè)氨基酸殘基組成，正確分子量為27141.32Da。93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS測(cè)定了天花粉的分子量。第98頁(yè)/共213頁(yè)天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量圖譜第99頁(yè)/共213頁(yè)天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量圖譜第100頁(yè)/共213頁(yè)分子量測(cè)定實(shí)例β-苦瓜子蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算(包括糖部分)的分子量為29156Da，用MALDI-TOF-MS測(cè)定的分子量為29074Da，二者相差82Da。這種差異可能是個(gè)別氨基酸測(cè)定的差錯(cuò)造成，估計(jì)整個(gè)結(jié)構(gòu)測(cè)定不會(huì)有大錯(cuò)誤。第101頁(yè)/共213頁(yè)分子量測(cè)定實(shí)例β-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法測(cè)定為-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全確定?？喙献拥鞍自?90位有一個(gè)色氨酸，我們用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分離，得到含有C端的一段小肽(59個(gè)氨基酸殘基)用MALDI-TOF-MS測(cè)定其分子量為6443與計(jì)算得到的59肽的分子量為6442.9非常相符，因此也就證明了C端59個(gè)氨基酸殘基的順序是正確的。

第102頁(yè)/共213頁(yè)β-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量第103頁(yè)/共213頁(yè)蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定

根據(jù)質(zhì)譜測(cè)定分子量的作用，質(zhì)譜還可用來(lái)作蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定。只要質(zhì)量有差異的雜質(zhì)都可以被檢出，此方法靈敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有獨(dú)到之處。第104頁(yè)/共213頁(yè)蛋白質(zhì)、多肽純度的鑒定實(shí)例1：天花粉蛋白C-端微觀不均一，即有二個(gè)C末端，一個(gè)多一個(gè)Ala(即247個(gè)氨基酸殘基)，一個(gè)少一個(gè)Ala(即246個(gè)氨基酸殘基)，用ESI-MS完全能夠分辨出來(lái)

第105頁(yè)/共213頁(yè)實(shí)例2：如豬胰島素和人胰島素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能夠清楚地分出二個(gè)峰。兩者的差異僅在豬胰島素B鏈的第30位為Ala(89.09Da)，而人胰島素相應(yīng)的位置為Thr(119.12Da)，兩者相差30Da（如圖13-11）。這些差異用其他方法是很難檢出的。

第106頁(yè)/共213頁(yè)蛋白質(zhì)鑒定肽質(zhì)量指紋譜+基于串聯(lián)質(zhì)譜多肽測(cè)序蛋白質(zhì)鑒定第107頁(yè)/共213頁(yè)肽質(zhì)量指紋譜由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸序列(一級(jí)結(jié)構(gòu))不同，蛋白質(zhì)被酶解后產(chǎn)生的肽段序列也各異，肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具特征性，稱為肽質(zhì)量指紋譜(peptidemassfingerprint,PMF)，可用于蛋白質(zhì)的鑒定。

第108頁(yè)/共213頁(yè)P(yáng)MF流程第109頁(yè)/共213頁(yè)肽質(zhì)量指紋譜

MALDI-TOF-MS是最有效的分析肽混合物的質(zhì)譜儀，肽混合物不需分離可直接分析，基質(zhì)輔助激光電離方法能耐受一定濃度的鹽，儀器靈敏度高，標(biāo)準(zhǔn)樣品1pmol的量就足夠，質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度可達(dá)0.1‰～0.01‰，且操作簡(jiǎn)單，分析速度快，依儀器型號(hào)不同一次可分析十幾個(gè)到幾十個(gè)樣品。第110頁(yè)/共213頁(yè)P(yáng)MF實(shí)例蓖麻毒素(ricin)

利用MALDI-TOF生物質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合肽質(zhì)量指紋譜方法，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，建立了鑒定檢測(cè)Ricin的新方法。第111頁(yè)/共213頁(yè)MALDI-TOF質(zhì)譜的測(cè)定，得到Ricin的分子量為62925Da第112頁(yè)/共213頁(yè)Ricin的肽質(zhì)量指紋譜，共檢出22條肽譜峰第113頁(yè)/共213頁(yè)將這些肽片段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用MASCOT搜索引擎在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PMF檢索，檢索參數(shù)如表1所示。返回前5個(gè)檢索結(jié)果，如表2所示。其中符合要求的結(jié)果(置信區(qū)間為得分大于66分)只有一種蛋白即蓖麻毒素:Ricinprecursor(P02879，RICI_RICCO)，得分107，匹配肽段13條，肽譜的實(shí)驗(yàn)值與理論值的對(duì)比見(jiàn)表3，其余未檢出的肽段中有4條經(jīng)過(guò)與理論值對(duì)照也找到了歸屬。第114頁(yè)/共213頁(yè)肽序列測(cè)定技術(shù)

兩種經(jīng)典測(cè)序方法：

DNA順序測(cè)定解決不了翻譯后加工所導(dǎo)致的氨基酸殘基的修飾的問(wèn)題；

Edman降解不能解決N端封閉的測(cè)序的問(wèn)題。第115頁(yè)/共213頁(yè)

蛋白梯形測(cè)序

(proteinladdersequencing)①使用少量鏈終止劑，進(jìn)行快速分步降解，在人為控制下產(chǎn)生一系列肽段，其中每個(gè)肽段于下一個(gè)之間只相差一個(gè)殘基；②用MALDI-TOF-MS讀出肽段信息。用此方法可在磷酸肽中定位磷酸絲氨酸殘基。研究N-端封閉的肽和蛋白，必須了解其C-端序列的信息。第116頁(yè)/共213頁(yè)蛋白梯形測(cè)序

(proteinladdersequencing)第117頁(yè)/共213頁(yè)肽測(cè)序一般方法（MS/MS）使用串聯(lián)質(zhì)譜，利用待測(cè)分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過(guò)分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基。其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂。第118頁(yè)/共213頁(yè)基于串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列測(cè)定用特定蛋白水解酶作用于蛋白質(zhì)，將得到的肽段送入一級(jí)質(zhì)譜，產(chǎn)生前體離子，經(jīng)過(guò)一定選擇的前體離子在碰撞室發(fā)生CID。結(jié)果是前體離子肽骨架酰胺鍵的特異性斷裂，并產(chǎn)生了一系列可用于確定氨基酸序列的y型和b型等離子。獲得CID二級(jí)質(zhì)譜圖后可算出肽序列。第119頁(yè)/共213頁(yè)經(jīng)過(guò)MS/MS分析的多肽片段

第120頁(yè)/共213頁(yè)N端和C端多肽GFPNAGFPNAGFPNAGFPNAGFPNAN-terminalpeptidesC-terminalpeptides415

486

30115457

71185332429第121頁(yè)/共213頁(yè)理論質(zhì)譜圖第122頁(yè)/共213頁(yè)理論質(zhì)譜圖與實(shí)際質(zhì)譜圖第123頁(yè)/共213頁(yè)理論質(zhì)譜圖與實(shí)際質(zhì)譜圖第124頁(yè)/共213頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)肽Glu-fib的MS/MS圖譜

第125頁(yè)/共213頁(yè)MS/MS優(yōu)點(diǎn)

MS/MS質(zhì)譜測(cè)序可對(duì)N端封閉的肽進(jìn)行測(cè)序;并可以通過(guò)CID得到部分至完全的序列信息后，做出MS肽譜，這可對(duì)修飾的氨基酸殘基定性，并確證其位置，包括二硫鍵的分布。而且質(zhì)譜技術(shù)與分離技術(shù)直接相連也可相互驗(yàn)證，同時(shí)還可對(duì)混合肽進(jìn)行測(cè)序。另外它還有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。第126頁(yè)/共213頁(yè)基于MS/MS蛋白質(zhì)鑒定獲得二級(jí)質(zhì)譜圖后可通過(guò)下列方法鑒定蛋白質(zhì)：①較常用的肽序列標(biāo)簽鑒定方法（peptidesequencetag，PST：從一級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的肽段中選擇母離子，進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，經(jīng)惰性氣體碰撞后肽段沿肽鏈斷裂，由所得到的各肽段質(zhì)量數(shù)差值推定肽段序列，用于數(shù)據(jù)庫(kù)查尋；②肽碎片離子搜索：直接用前體離子產(chǎn)生的未解析的CID圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的CID圖譜比較，如Sequest、Mascot、Sonat等算法；③從頭測(cè)序法（denovosequence），通過(guò)直接解釋MS/MS數(shù)據(jù)識(shí)別肽序列，這類系統(tǒng)和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等。

第127頁(yè)/共213頁(yè)基于MS/MS的蛋白質(zhì)鑒定第128頁(yè)/共213頁(yè)串聯(lián)質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用第129頁(yè)/共213頁(yè)測(cè)序其它方法先用幾種不同的蛋白水解酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)SV8酶(staphylococcusaureusV8)各種酶解片段用HPLC等分離得到的純肽或簡(jiǎn)單的混合肽，可用MS/MS測(cè)定其各組分的順序，然后從不同蛋白水解酶酶解片段順序，找到其重疊部分，即可得到整個(gè)蛋白質(zhì)順序。第130頁(yè)/共213頁(yè)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾鑒定磷酸化修飾糖基化修飾巰基和二硫鍵定位氨基的乙?；核鼗揎椀?31頁(yè)/共213頁(yè)磷酸化修飾已知的磷酰氨基酸的類型有四種：

1．O-磷酸鹽，通過(guò)羥氨酸的磷酸化形成的，如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。

2．N-磷酸鹽，通過(guò)精氨酸，賴氨酸或組氨酸中的氨基的磷酸化形成的。

3．乙酰磷酸鹽，通過(guò)天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。

4．S-磷酸酯，通過(guò)半胱氨酸的磷酸化形成的。

第132頁(yè)/共213頁(yè)磷酸化肽富集分離技術(shù)有：雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP)；高分辨率的凝膠電泳(2DE)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)。對(duì)于32P標(biāo)記的磷酸化肽或蛋白可用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測(cè)，提取后可以高靈敏度MALDI-MS分析；如果32P標(biāo)記不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC與質(zhì)譜聯(lián)用。

常用的富集方法有：固定金屬親和色譜(IMAC)；抗體免疫沉淀；化學(xué)修飾。第133頁(yè)/共213頁(yè)質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化肽和確定磷酸化位點(diǎn)的方法

①

MALDI-TOF-MS可以通過(guò)肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質(zhì)，與磷酸酯酶處理相結(jié)合可以確定磷酸化位點(diǎn)。

原理：磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽丟失磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生特定質(zhì)量數(shù)的變化，MALDI-TOF-MS通過(guò)檢測(cè)這種質(zhì)量數(shù)的變化而確定磷酸化位點(diǎn)。第134頁(yè)/共213頁(yè)

②串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)進(jìn)行前體離子掃描，這一方法是通過(guò)檢測(cè)磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的特定片段來(lái)報(bào)告磷酸肽的存在。

原理：磷酸化肽經(jīng)CID后會(huì)產(chǎn)生磷酸基團(tuán)的特異性片段，這些特異性的片段在用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行前體離子掃描時(shí)可作為磷酸肽的“報(bào)告離子”。

質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化肽和確定磷酸化位點(diǎn)的方法第135頁(yè)/共213頁(yè)串聯(lián)質(zhì)譜還可進(jìn)行中性丟失掃描，這種方法是用MS/MS檢測(cè)經(jīng)CID后發(fā)生中性丟失H3PO4(98u)的肽段。LC-MS/MS分析磷酸化位點(diǎn)傅立葉變換質(zhì)譜進(jìn)行電子捕獲解離

質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化肽和確定磷酸化位點(diǎn)的方法第136頁(yè)/共213頁(yè)糖基化修飾蛋白質(zhì)糖基化可分為4類:N-糖基化

O-糖基化

C-甘露糖化聚糖磷脂酰肌醇錨(GPI-anchor)糖基化第137頁(yè)/共213頁(yè)糖蛋白糖苷內(nèi)切酶還原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-MS糖含量相對(duì)分子質(zhì)量ESI串聯(lián)質(zhì)譜MALDI-TOF-MS凝集素提取氨基酸序列糖基化位點(diǎn)糖肽片段糖蛋白結(jié)構(gòu)分析示意圖第138頁(yè)/共213頁(yè)糖基化位點(diǎn)確定先用蛋白酶將糖蛋白酶解成含有和不含有糖鏈的肽片段，獲得糖蛋白的肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶將肽鏈切除，PMF發(fā)生變化，原含有糖肽段的質(zhì)量由于糖鏈的丟失在質(zhì)譜圖上發(fā)生位移，通過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在這個(gè)序列中必含有糖基化位點(diǎn)，由此我們可以確定糖蛋白分子中的糖基化位點(diǎn)。第139頁(yè)/共213頁(yè)糖基化分析用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，就能直接表述糖鏈的平均質(zhì)量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖鏈的平均質(zhì)量占糖蛋白平均相對(duì)分子質(zhì)量的百分比來(lái)表示。應(yīng)用ESI，對(duì)PMF中的肽片段進(jìn)行分析，可以得到蛋白某中間片段的序列，對(duì)已知蛋白，依靠此序列，判斷其歸屬，從而對(duì)糖蛋白的氨基酸序列加以證實(shí)。不同的質(zhì)譜方法可以產(chǎn)生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞誘導(dǎo)解離(CID)譜，這可以給出有關(guān)糖的序列，分支及糖間的連接等信息。

第140頁(yè)/共213頁(yè)第141頁(yè)/共213頁(yè)糖基化修飾常用的糖蛋白質(zhì)分離富集技術(shù)有:凝集素親和技術(shù)、肼化學(xué)富集法、親水相互作用色譜法、β消除麥克爾加成反應(yīng)?；谫|(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)鑒定及糖基化位點(diǎn)確定方法有:PNGaseF酶法、EndoH酶法、β-消除麥克爾加成反應(yīng)、三氟甲基磺酸法。第142頁(yè)/共213頁(yè)巰基和二硫鍵定位

原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巰基蘇糖醇等試劑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化和還原烷基化,結(jié)合蛋白酶切、肽譜技術(shù),利用生物質(zhì)譜的準(zhǔn)確分子量測(cè)定,可實(shí)現(xiàn)對(duì)二硫鍵和自由巰基的快速定位與確定。這在含有多二硫鍵結(jié)構(gòu)的活性多肽與蛋白質(zhì)研究中有重要用途。第143頁(yè)/共213頁(yè)泛素化修飾原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly結(jié)構(gòu)，經(jīng)胰蛋白酶水解后，Gly-Gly留在被修飾蛋白質(zhì)的肽鏈上，使肽段質(zhì)量增加114

，起到質(zhì)量標(biāo)記泛素化位點(diǎn)的作用，進(jìn)而通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定泛素化位點(diǎn)。第144頁(yè)/共213頁(yè)其他翻譯后修飾乙?；谆入赘孰幕?45頁(yè)/共213頁(yè)質(zhì)譜的其他應(yīng)用蛋白質(zhì)的折疊抗原決定部位指認(rèn)蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金屬之間的作用細(xì)胞和病毒分析等藥物代謝鑒定第146頁(yè)/共213頁(yè)蛋白質(zhì)類藥物的體外聚乙二醇修飾（PEG化）(1)增大藥物分子量，避免被腎小球過(guò)濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(diǎn)(4)增加藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學(xué)鍵在體內(nèi)隨時(shí)間水解，緩慢釋放藥物

+蛋白或多肽偶聯(lián)物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH第147頁(yè)/共213頁(yè)國(guó)際上PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展美國(guó)Rutgers大學(xué)Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的應(yīng)用美國(guó)Enzon公司美國(guó)最早從事PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的公司美國(guó)Shearwaters公司各種PEG修飾劑的生產(chǎn)商美國(guó)羅氏、先靈寶雅、安進(jìn)PEG藥物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：輝瑞、默克、葛蘭素史克、施貴寶。。。第148頁(yè)/共213頁(yè)國(guó)內(nèi)PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展國(guó)家863重大機(jī)密項(xiàng)目：人工血液代用品的研制，1997-2000中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目：血液代用品和血液凈化，2001-2005國(guó)家重大科技專項(xiàng)課題《創(chuàng)新藥物和中藥現(xiàn)代化》：長(zhǎng)效基因工程蛋白質(zhì)和多肽制劑關(guān)鍵技術(shù)，2002-2005國(guó)家863重點(diǎn)項(xiàng)目課題：核酸和多肽的修飾和劑型化技術(shù)，2007-2010PEG修飾血紅蛋白：I期臨床（中科院過(guò)程所、凱正公司）PEG修飾G-CSF：III期臨床（格蘭百克）第149頁(yè)/共213頁(yè)修飾粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF） 延長(zhǎng)半衰期修飾人腫瘤壞死因子 消除副作用修飾白介素I受體拮抗劑（rhIL-1Ra） 延長(zhǎng)半衰期修飾牛胰核糖核酸酶（RNase） 提高抗腫瘤活性修飾超氧化物歧化酶（SOD） 提高半衰期修飾天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性 提高半衰期修飾人干擾素（IFN） 提高半衰期修飾血紅蛋白（Hb） 血液代用品修飾胰島素 提高半衰期我國(guó)在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作第150頁(yè)/共213頁(yè)Sc-PEG專利分析以PEG-OH為原料的必然途徑CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH+光氣+NHSCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N

+NH2——G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF

O單鏈修飾：(SC-PEG)第151頁(yè)/共213頁(yè)Roche公司的長(zhǎng)效干擾素產(chǎn)品專利分析同樣是以PEG-OH為原料的必然途徑雙鏈修飾：第152頁(yè)/共213頁(yè)新的修飾策略采用新方法制備新的修飾劑以PEG-COOH（CM-PEG)為原料的必然途徑，已獲專利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N+NH2——G-CSFOOO單鏈修飾：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH——G-CSFO(CM-PEG)第153頁(yè)/共213頁(yè)策略以PEG-COOH為原料的必然途徑CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO雙鏈修飾：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH+LysineOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+NH2——IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NH——IFN第154頁(yè)/共213頁(yè)1、PEG修飾劑的批量制備取得了成功取得的主要進(jìn)展分枝型ZL01141745.5分叉(長(zhǎng)尾)型ZL03100736.8可逆型ZL03105003.4不可逆型200410029577.1ZL02120740.2異端基雙官能團(tuán)200410029577.1第155頁(yè)/共213頁(yè)聚乙二醇修飾劑產(chǎn)品產(chǎn)品號(hào)末端基團(tuán)分子量包裝（g）價(jià)格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羥基琥珀酰亞胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羥基琥珀酰亞胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羥基琥珀酰亞胺20K1001053