人微小病毒B19感染與Kikuchi病的相關(guān)性

人微小病毒B19感染與Kikuchi病的相關(guān)性【摘要】目的：研究人微小病毒B19感染與組織細(xì)胞性壞死性淋巴結(jié)炎(KFD)的相關(guān)性.方法：采用雙盲法在32例KFD患者及13例正常對照淋巴結(jié)活檢組織中用原位雜交和免疫組織化學(xué)染色方法檢測B19病毒基因組DNA和病毒蛋白.并采用原位雜交和免疫組化雙標(biāo)記法確定病毒感染的細(xì)胞類型.結(jié)果：在32例KFD患者淋巴結(jié)中，B19病毒DNA和病毒蛋白陽性率分別為%和%，而在對照淋巴結(jié)中，二者陽性率分別為%和%.統(tǒng)計學(xué)分析顯示B19病毒基因組DNA和病毒蛋白在KFD中有更高感染率(P值分別為和).病毒感染的細(xì)胞大部分為淋巴細(xì)胞，少數(shù)組織細(xì)胞也是病毒感染的靶細(xì)胞.結(jié)論：微小病毒B19在KFD中有更高的感染率，微小病毒B19與KFD的發(fā)病有密切關(guān)系.

【關(guān)鍵詞】組織細(xì)胞性壞死性淋巴結(jié)炎；微小病毒B19；原位雜交；免疫組織化學(xué)

0引言

組織細(xì)胞性壞死性淋巴結(jié)炎(KikuchiFujimotoDisease,KFD)由Kikuchi和Fujimoto于1970年首先報道.是一種主要累及淋巴結(jié)的自限性全身性疾病，世界各地均有報道，但以東方青年女性多見.其病理特征主要為淋巴組織散在灶片狀壞死，伴有大量組織細(xì)胞浸潤，易與淋巴瘤混淆，病因尚不清楚.曾有研究者發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和嗜血細(xì)胞綜合癥伴發(fā)KFD樣淋巴結(jié)改變患者中檢測到人微小病毒B19［1-2］，但對于B19病毒與原發(fā)性KFD的關(guān)系，僅Chiu等［3］用免疫組化的方法檢測了10例KFD患者的淋巴結(jié)活檢標(biāo)本，但未得到陽性結(jié)果.在此，我們觀察了人微小病毒B19基因組DNA及病毒衣殼蛋白在原發(fā)性KFD中的表達情況，以探討二者的關(guān)系.

1材料和方法

材料KFD組織活檢標(biāo)本32(男11,女21)例來源于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院及唐都醫(yī)院病理科，均經(jīng)HE及CD68免疫化學(xué)染色并結(jié)合臨床表現(xiàn)確診.患者年齡10～69(中位年齡25)歲.31例(97%)來源于頸部淋巴結(jié)；16例(50%)發(fā)病時有發(fā)熱.所有患者均無皮疹、關(guān)節(jié)炎等癥狀，自身抗體陰性.同時，以13例乳腺癌或胃癌患者未轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)做為標(biāo)本對照.所有活檢標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)固定，石蠟包埋.實驗過程及結(jié)果觀察均采用雙盲法.地高辛標(biāo)記及檢測試劑盒；TaqDNA聚合酶和dNTP；鼠抗微小病毒B19衣殼蛋白VP1/VP2mAb；CD68mAb；染色HistostainSAP試劑盒；顯色用NBT/BCIP.

圖1組織細(xì)胞性壞死性淋巴結(jié)炎HE×200

方法

探針的制備以PCR擴增所得173bp大小的B19病毒基因組DNA片段(對應(yīng)于病毒基因組序列的3400～3572bp)，經(jīng)測序驗證后作為標(biāo)記探針的模板.PCR引物依據(jù)文獻［4］由上海生工生物工程合成，所用標(biāo)記方法依據(jù)試劑盒說明書.

原位雜交操作方法依據(jù)說明書及文獻［5］.石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，逐級乙醇脫水，mol/L鹽酸酸化10min，g/L蛋白酶K37℃消化10min.mol/LPBS洗后逐級乙醇脫水，空氣干燥.預(yù)雜交30min后每張切片加15μLB19特異性探針，95℃變性10min，聚冷10min后于濕盒中42℃過夜.逐級2×SSC,1×SSC,×SSC,×SSC,×SSC振洗.封閉緩沖液37℃封閉30min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體置37℃，3h.Washing緩沖液振洗30min，加入NBT/BCIP混合物避光顯色.觀察到明確陽性信號后終止顯色，脫水、透明、中性樹膠封片.以預(yù)雜交液和標(biāo)記試劑盒所帶標(biāo)記上地高辛的質(zhì)粒pBR328線性DNA做為陰性對照.

免疫組織化學(xué)組織片經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水，經(jīng)3mL/L過氧化氫―甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶、100g/LBSA封閉非特異性結(jié)合位點后，加入B19特異性mAb4℃過夜.第2日切片經(jīng)37℃復(fù)溫、PBS洗后加入生物素化二抗于37℃孵育20min，PBS洗，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素復(fù)合物，37℃孵育20min，PBS洗后加入NBT/BCIP避光顯色.陽性信號出現(xiàn)后終止顯色，脫水、透明、中性樹膠封片.染色中以相同Ig濃度抗人神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白抗體(與B19抗體同屬IgGG1亞類)和PBS分別做替換對照和陰性對照.

原位雜交-免疫組化雙標(biāo)記免疫組化依上述方法進行.100g/LBSA封閉非特異性結(jié)合位點后，高壓修復(fù)抗原表位.加入抗人組織細(xì)胞單抗表面標(biāo)記CD68mAb于37℃孵育2h，PBS洗，加入生物素化二抗，37℃孵育20min，PBS洗，加入標(biāo)記過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素復(fù)合物，37℃孵育20min，PBS洗后加入DAB顯色.陽性信號出現(xiàn)后終止顯色，進入原位雜交染色程序，方法同前述.滿意陽性信號出現(xiàn)后切片脫水、透明、中性樹膠封片.統(tǒng)計學(xué)處理：B19病毒原位雜交及免疫組化陽性例數(shù)在兩組中分別以陽性率表示，兩組之間差別做χ2檢驗，用SPSS軟件完成.表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果

原位雜交B19特異性探針原位雜交陽性信號位于細(xì)胞核中，陽性細(xì)胞主要分布于濾泡間區(qū)，在壞死區(qū)及生發(fā)中心只有少量散在陽性細(xì)胞(圖2).

圖2組織細(xì)胞性壞死性淋巴結(jié)炎B19特異性探針原位雜交NBT/BCIP×400

免疫組織化學(xué)病毒蛋白既存在于胞質(zhì)，也存在于胞核中，且在所有陽性組織中均可見到此種分布，但在某一陽性病例中以胞質(zhì)或胞核中的一種分布為主(圖3).

原位雜交-免疫組化雙標(biāo)記大量B19特異性探針雜交陽性細(xì)胞CD68抗體染色陰性，只有少數(shù)組織細(xì)胞原位雜交信號陽性(圖4).表明B19感染細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞，少量為組織細(xì)胞.經(jīng)原位雜交和免疫組化檢出的KFD組B19病毒基因組DNA和病毒蛋白陽性率見表1，經(jīng)χ2檢驗分析兩組差別明顯()，即KFD組人微小病毒B19感染率明顯高于對照組.陽性信號在胞核(粗箭頭)和胞質(zhì)(細(xì)箭頭)中均可看到，但本例以胞核為主.圖3B19特異性抗體免疫組化染色結(jié)果NBT/BCIP×400一個組織細(xì)胞(灰粗箭頭)和數(shù)個淋巴細(xì)胞(細(xì)箭頭)B19病毒DNA陽性，

大量組織細(xì)胞(黑粗箭頭)則為陰性.圖4組織細(xì)胞性壞死性淋巴結(jié)炎中B19原位雜交-CD68免疫組化染色雙染結(jié)果NBT/BCIP及DAB×400

表1原位雜交及免疫組化檢測B19病毒陽性率

3討論

人微小病毒B19基因組全長5596bp，主要編碼3個蛋白：衣殼蛋白VP1，VP1及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1.研究［6］發(fā)現(xiàn)B19可以引起第五病(erythemainfectiosum)、關(guān)節(jié)炎、胎兒水腫、一過性再生障礙性貧血、心肌炎等疾病.Meyer等［1］在3例伴發(fā)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的KFD患者血清中發(fā)現(xiàn)了B19特異性抗體IgM和IgG.此后，Yufu等［2］先后在噬血細(xì)胞綜合征患者血清及淋巴結(jié)活檢組織中發(fā)現(xiàn)了B19抗體、B19基因組DNA和病毒蛋白，這些患者的淋巴結(jié)活檢發(fā)現(xiàn)類似于KFD的特征.但都繼發(fā)或伴發(fā)于其它疾病或疾病過程，并不是真正的原發(fā)性KFD.Chiu等［3］用免疫組化的方法檢測了10例原發(fā)性KFD患者的淋巴結(jié)活檢標(biāo)本，未得到陽性結(jié)果，不過他當(dāng)時的研究并不是以B19病毒為主，而且使用的是B19多抗.我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)B19病毒基因組DNA及病毒蛋白在KFD患者淋巴結(jié)中的陽性率遠(yuǎn)高于對照組.表明在KFD組中人微小病毒B19的感染率遠(yuǎn)高于對照組.

經(jīng)典的B19感染細(xì)胞主要為紅系幼稚細(xì)胞.我們通過原位雜交―免疫組化雙重染色的方法初步揭示了在KFD中B19感染細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞，少數(shù)為組織細(xì)胞，這與近年發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞和組織細(xì)胞具有B19受體相一致［7］.研究［8］發(fā)現(xiàn)，B19病毒感染可以介導(dǎo)抗雙鏈DNA抗體和抗淋巴細(xì)胞自身抗體的出現(xiàn).B19病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1除了直接引起細(xì)胞凋亡外，還可以引起IL1，IL2，IL6，TNFα，IFNγ等炎癥因子的分泌，而這些炎癥因子可以在B19病毒相關(guān)性關(guān)節(jié)炎、自身免疫狀態(tài)異常患者中引起炎癥和細(xì)胞損傷［9］.而B19感染所引起的促炎癥因子分泌很可能就是導(dǎo)致KFD細(xì)胞壞死的原兇.這不但有助于更進一步研究KFD的發(fā)病機制，而且為臨床治療及預(yù)防KFD提供了新的思路.

【參考文獻】

［1］MeyerO,KahnMF,GrossinM,etal.ParvovirusB19infectioncaninducehistiocyticnecrotizinglymphadenitis(Kikuchisdisease)associatedwithsystemiclupuserythematosus［J］.Lupus,1991,1(1):37-41.

［2］YufuY,MatsumotoM,MiyamuraT,etal.ParvovirusB19associatedhaemophagocyticsyndromewithlymphadenopathyresemblinghistiocyticnecrotizinglymphadenitis(Kikuchisdisease)［J］.BrJHaematol,1997,96(4):868-871.

［3］ChiuCF,ChowKC,LinTY,etal.VirusinfectioninpatientswithhistiocyticnecrotizinglymphadenitisinTaiwan.DetectionofEpsteinBarrvirus,typeIhumanTcelllymphotropicvirus,andparvovirusB19［J］.AmJClinPathol,2000,113(6):774-781.

［4］BultmannBD,KlingelK,SotlarK,etal.ParvovirusB19:apathogenresponsibleformorethanhematologicdisorders［J］.VirchowsArch,2003,442(1):8-17.

［5］MehraeinY,LennerzC,EhlhardtS,etal.DetectionofparvovirusB19capsidproteinsinlymphocyticcellsinsynovialtissueofautoimmunechronicarthritis［J］.ModPathol,2003,16(8):811-817.

［6］YoungNS,BrownKE.ParvovirusB19［J］.NEnglJMed,2004,350(6):586-597.

［7］CoolingLL,ZhangdeS,NaidesSJ,etal.Glycosphingolipidexpressioninacutenonlymphocyticleukemia:commonexpressionofshigatoxinandparvovirusB19receptorsonearlymyeloblasts［J］.Blood,2003,101(2):711-721.

［8］SoloninkaCA,AndersonMJ,LaskinCA.AntiDNAandantilymphocyteantibodiesduringacuteinfectionwithhumanparvoviru