醫(yī)療器械檢化員微生物培訓

關于醫(yī)療器械檢化員微生物培訓第一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日一、人員資質(zhì)及培訓要求

從事醫(yī)療器械微生物檢驗工作的人員應具備微生物學或相近專業(yè)知識的教育背景。檢驗人員應依據(jù)所在崗位和職責接受相應的培訓，在確認它們可以承擔某一檢驗前，他們不能獨立從事該項微生物檢驗。應保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必須的設備操作、微生物檢驗技術和實驗室生物安全等方面的培訓，經(jīng)考核合格后方可上崗，同時，實驗室應制定所有級別試驗人員的繼續(xù)教育計劃。檢驗人員必須熟悉相關監(jiān)測方法、程序、檢驗目的和結(jié)果評價。微生物實驗室的管理者其專業(yè)技能和經(jīng)驗水平應與他們的職責范圍相符，如：管理技能、實驗室安全、檢驗安排、預算、實驗研究、實驗結(jié)果的評估和數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查、技術報告書寫等。第二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日

二、實驗室環(huán)境控制【原則】實驗室布局設計的基本原則是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止檢驗過程對環(huán)境和人員造成危害。通常，實驗室應劃分成潔凈或無菌區(qū)域和活菌操作區(qū)域，同時應根據(jù)試驗目的，在時間或空間上有效分隔不相容的試驗活動，將交叉污染的風險降低到最低。一般情況下，醫(yī)療器械微生物檢驗的實驗室應具有開展無菌檢查、微生物限度檢查等檢測活動的、獨立設置的潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并為上述檢驗配備相應的細菌（真菌）等實驗室、培養(yǎng)室、文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時，應對上述區(qū)域明確標識。第三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日二、實驗室環(huán)境控制【要求】1、無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行。用于無菌檢查和微生物限度檢查的潔凈操作室應配有屬于“人流凈化”的更衣室及屬于“物流凈化”的緩沖間或傳遞窗（柜），使進入潔凈操作室的實驗人員和實驗物品分別經(jīng)適當凈化后進入實驗操作間。無菌室分無菌操作室和緩沖間。無菌操作室應具有空氣除菌過濾的單向流空氣裝置。操作室或工作臺應保持正壓。應在壓差十分重要的相鄰級別區(qū)之間安裝壓差表。第四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日二、實驗室環(huán)境控制【要求】2、微生物限度檢查的全過程，均應遵守無菌操作，嚴防再污染。因此，微生物限度檢查宜在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行；限度檢查實驗室應配有相應的人流和物流緩沖間，并定期作環(huán)境監(jiān)測。第五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日二、實驗室環(huán)境控制

【要求】

3、菌種處理、微生物鑒別和陽性對照室菌種的處理包括的內(nèi)容比較多，如菌種的傳代、保藏、制備以及培養(yǎng)基促生長實驗、陽性對照、微生物方法驗證、消毒劑和防腐劑的效力測定和對環(huán)境中分離菌的鑒別等，這些實驗過程中都在處理活的微生物，處理不當會造成實驗室環(huán)境污染，影響其他實驗結(jié)果，因此，該室必須與其他實驗室嚴格分開；必要時，應按實驗室性質(zhì)的需要保持對相鄰實驗室的相對壓差；需采取必要的消毒方式確保實驗室潔凈條件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以凈化層流臺作為局部100級的控制措施，最好是使用生物安全柜，所有的與活毒菌種相關的活動都應在層流臺或生物安全柜中進行。每次實驗結(jié)束后要對層流臺或生物安全柜及整個實驗室環(huán)境進行消毒。所有與菌種相關的實驗廢物均應經(jīng)過滅菌處理后方可丟棄。第六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日二、實驗室環(huán)境控制【要求】4、培養(yǎng)室及其他功能間培養(yǎng)室用于放置培養(yǎng)細菌和真菌的培養(yǎng)箱。準備區(qū)即試液及培養(yǎng)基配制/滅菌區(qū)域、實驗器皿洗滌、烘干、滅菌、實驗用品及易耗品儲藏等沒有特殊要求的功能間，可為一般清潔環(huán)境。第七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日微生物環(huán)境控制相關標準GB/T16292:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子測試方法GB/T16293:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌測試方法GB/T16294:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌測試方法GB50073-2001潔凈廠房設計規(guī)范ISO14644-1:1999潔凈室及相關受控環(huán)境第1部分：空氣潔凈度等級劃分ISO14644-4:1999潔凈室及相關受控環(huán)境第4部分：設計、施工、運行ISO14644-7:1999潔凈室及相關受控環(huán)境第7部分：分離的設備第八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌室環(huán)境控制設備微粒計數(shù)儀第九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌室環(huán)境控制設備浮游菌采樣儀第十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌室環(huán)境控制設備第十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日潔凈室沉降菌測試方法1.測試時間1.1對單向流，如100級凈化房間及層流工作臺，測試應在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運行不少于10min后開始。1.2對非單向流，如10000級、100000級以上的凈化房間，測試應在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運行不少于30min后開始。2.采樣方法將已制備好的培養(yǎng)皿按要求放置，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5h，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。2.2.培養(yǎng)全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30℃～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于48h。每批培養(yǎng)基應有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染。可每批選定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。第十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日潔凈室沉降菌測試方法3.菌落計數(shù)用肉眼直接計數(shù)，標記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。4.注意事項4.1測試用具要作滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。4.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。4.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細的記錄。4.4由于細菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。4.5采樣前應仔細檢查每個培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應剔除。第十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日潔凈室沉降菌測試方法5.測試規(guī)則5.1.測試狀態(tài)5.1.1沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達到規(guī)定的要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速必須控制在規(guī)定值內(nèi)。5.1.2沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）已經(jīng)過消毒。5.1.3測試狀態(tài)有靜態(tài)和動態(tài)兩種，測試狀態(tài)的選擇必須符合生產(chǎn)的要求，并在報告中注明測試狀態(tài)。5.2.測試人員5.2.1測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級別的工作服。5.2.2靜態(tài)測試時，室內(nèi)測試人員不得多于二人。第十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日最少采樣點數(shù)目第十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日同時滿足最少平皿數(shù)第十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日采樣點的布置采樣點的位置可以同懸浮粒子測試點。a）工作區(qū)采樣點的位置離地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。b）可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加采樣點。采樣點位置的詳細規(guī)則見附錄B（標準的附錄）。第十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日采樣點布置第十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日環(huán)境檢測參照標準第十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日微生物實驗室管理嚴格區(qū)分污染區(qū)及清潔區(qū)第二十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日相關標準GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準GB15980-1995一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標準GB15981-1995消毒與滅菌效果的評價方法和標準第二十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日三、滅菌控制

微生物實驗使用的試劑、器材等常需用濕熱滅菌法。濕熱滅菌的溫度和時間需驗證，必須保證物品滅菌后無菌保證值SAL≤10-6。滅菌程序經(jīng)驗證合格后方可使用。定期進行BD實驗、真空泄漏測試、溫度參數(shù)測試（空載熱分布、定載熱穿透、滿載熱穿透）、壓力改變速率測試（GB8599-2008大型蒸汽滅菌器技術要求），同時以生物指示劑驗證滅菌效果,必須保證物品滅菌后無菌保證值SAL小于百萬分之一。第二十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日三、滅菌控制

所有器具應采用可靠方法滅菌置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min或置電熱干燥箱內(nèi)180℃2h。第二十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日濕熱滅菌控制相關標準GB18281.3-2000醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物指示物第3部分:濕熱滅菌用生物指示物ISO11138-3-2006醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌.生物指示物.第3部分:濕熱滅菌用生物指示劑第二十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日四、培養(yǎng)基管理1、培養(yǎng)基的制備2、培養(yǎng)基的貯藏3、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制實驗第二十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日四、培養(yǎng)基管理靈敏度檢查（中國藥典2010）無菌檢查（ISO11737.2:2009或GBT19973.2-2005）第二十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日五、無菌操作定義：是指在執(zhí)行實驗過程中，防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術和管理方法。無菌操作技術是微生物實驗的基本技術，是保證微生物實驗準確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。無菌操作技術主要包括兩方面：創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境及在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入。創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。第二十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日微生物實驗前準備微生物實驗控制1：人員管理微生物實驗控制2：環(huán)境控制微生物實驗控制3：滅菌控制微生物實驗控制4：培養(yǎng)基管理微生物實驗控制5：無菌操作第二十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日微生物基本操作

瓊脂平板接種法瓊脂斜面接種法半固體接種法肉湯培養(yǎng)基接種法第二十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日瓊脂平板接種法細菌在自然界及人體中分布廣，種類多，為了了解菌譜，須先將各種細菌分離，獲得純菌培養(yǎng)物后才能進一步作細菌的鑒定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達到分離的目的，常稱分離培養(yǎng)法。平板接種方法有多種。以下介紹平行劃線法及分區(qū)劃線法。第三十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）分區(qū)劃線法第三十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）平行劃線法第三十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）第三十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日單個菌落第三十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日單個菌落第三十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日瓊脂斜面接種法目的：多用于純種細菌的增菌和保存菌種方法：用滅菌接種環(huán)取細菌培養(yǎng)物少許。拔去瓊脂斜面培養(yǎng)基塞，管口經(jīng)火焰上滅菌，將沾有細菌的接種環(huán)伸入管內(nèi)，自下而上在瓊脂上蜿蜒劃線；接種后，管口在火焰上滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌：在試管口處做好標記，置37℃培養(yǎng)18－24小時第三十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面第三十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日肉湯接種法目的：用于增菌。方法：用滅菌接種環(huán)取細菌培養(yǎng)物少許；以無菌操作將沾有細菌的接種環(huán)伸入肉湯中，將環(huán)上細菌輕輕研磨于接近液面的管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細菌即可；接種后管口滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌，并做好標記，置37℃培養(yǎng)18-24小時第三十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日半固體接種法（穿刺接種法）目的：增菌和保存菌種；觀察細菌有無動力。方法：用接種針，將取有細菌的接種針自培養(yǎng)基中央刺入（不要接觸管底），沿原穿刺線撥出，注意在刺入與拔出時不可晃動接種針；接種后做好標記。置37℃培養(yǎng)18-24小時．第三十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）

第四十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日菌懸液制備（使用麥氏比濁管）麥氏比濁管：是McFarland發(fā)明的一種用于微生物比濁的不同濁度的標準濁度管。具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來定的，有表可查，這樣不同比例生成的硫酸鋇沉淀的濃度不同，且都有定值。第四十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日麥氏比濁管的配比第四十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日菌懸液制備（使用麥氏比濁管）【材料】1、實驗所需的微生物新鮮培養(yǎng)物如：金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物；2、無菌生理鹽水、麥氏比濁管；3、酒精燈、接種環(huán)、無菌吸管、平皿。第四十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日菌懸液制備（使用麥氏比濁管）【方法】1、輕搖標準試管；2、無菌操作挑取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至無菌生理鹽水試管（與標準管相同直徑）中混勻，直到濁度與所要求的標準管的濃度相同；3、序列稀釋已挑取菌落的生理鹽水試管至所需的菌液濃度如：100cfu/ml;4、用平皿計數(shù)法驗證所配置菌液的實際濃度。第四十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日菌懸液制備（使用麥氏比濁管）【使用技巧】1、直接用眼睛看（需要經(jīng)驗，誤差較大）。2、找張白紙打上平行直線，利用光在不同濃度液體折射不同幫助觀察比較。第四十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日麥氏1號管稀釋梯度表（cfu/ml）第四十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日菌懸液制備（使用分光光度儀）分光光度儀

第四十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日菌懸液制備的保存菌懸液制備：菌懸液制備后應在2小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時內(nèi)使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)替代對應量的新鮮孢子懸液使用。第四十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查

靈敏度檢查所需的六種菌：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]ATCC6538銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]ATCC9027枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]ATCC6633生孢梭菌[CMCC(B)64941]ATCC11437白色念珠菌[CMCC(F)98001]ATCC10231黑曲霉[CMCC(F)98003]ATCC16404根據(jù)培養(yǎng)基的功能選擇靈敏度實驗所需菌種第四十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日中國藥典2005年版明確規(guī)定：培養(yǎng)基靈敏度、微生物限度檢查法檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第五十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日中國藥典2010年版在新增的“藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則”中對菌種有了較為明確的規(guī)定：允許使用標準菌株和商業(yè)派生菌株標準菌株應按保藏機構提供的說明進行復活標準儲備菌株應進行純度和特性確認標準儲備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標準儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標準菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第五十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日菌株傳代基本概念標準菌株：由國內(nèi)或國際菌種保藏機構保藏的，遺傳學特性得到確認和保證并可追溯的菌株。（0代）標準儲備菌株：由標準菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。（1代）商業(yè)派生菌株：由供應商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株。（2代）工作菌株：由標準儲備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。（2代）代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。第五十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日采購的第2代超低溫冷凍標準儲備菌種工作菌種第3代工作菌種第3代工作菌種第4代工作菌種第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代制備工作菌種進行菌種保藏的模式圖第五十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日各類菌種保藏條件及時間

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時間細菌一般多用于營養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個月，其它細菌每個月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般4~6個月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個月移植一次（每2個月移植一次）第五十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日

菌種保管

?菌種保管應有專人負責，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。?菌種應有詳細登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。?各種菌種應按規(guī)定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時，應及時更換。?購置菌種，應有介紹信。全部保存菌種應具備清單，并定期向部門負責人報告。

第五十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日FTM的靈敏度檢查第五十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查接種金黃色葡萄球菌、緑膿桿菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種生胞梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d,加3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml孢子懸液備用。第五十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第五十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)基質(zhì)量控制：無菌檢查每批滅菌的培養(yǎng)基隨機取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應無菌生長。第五十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗第六十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗預防假陽性措施1在一個專門準備、環(huán)境控制的房間內(nèi)的層流罩的環(huán)境中進行測試2在整個測試過程中使用無菌技術3用避免污染的方法把測試器皿、培養(yǎng)基和測試物品引入測試區(qū)4測試產(chǎn)品表面的細菌污染，在引導測試物品進入測試區(qū)之前，先對產(chǎn)品的外包裝進行消毒。5對測試中使用的設備、材料和產(chǎn)品進行滅菌6簡化進行測試必須的操作7盡量避免懸浮微粒的產(chǎn)生8環(huán)境時時監(jiān)測（沉降菌檢測）第六十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗相關標準GBT19973.2-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學方法第二部分：確認滅菌過程的無菌試驗ISO11737-22009-醫(yī)用器材的滅菌微生物學方法第二部分：確認滅菌過程的無菌試驗第六十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗：培養(yǎng)條件不論哪種無菌試驗方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天；改良馬丁23-28℃，不少于14天。如果14以內(nèi)觀察到陽性結(jié)果，不必繼續(xù)培養(yǎng)。第六十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗陽性對照應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品．以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗霉菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。加菌量小于l00cfu，供試品用量同供試品無菌實驗時每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應生長良好．第六十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日陰性對照陰性對照：陰性對照供試品無菌實驗時，應取相應溶劑和稀釋同法操作作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。第六十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗：結(jié)果判斷肉湯培養(yǎng)基有菌生長的常見三種形式：混濁生長：液體變混濁。菌膜：液體澄清，表面有一薄層菌膜。沉淀生長：液體澄清，管底有沉淀物第六十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日混濁生長：液體變混濁第六十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日肉湯培養(yǎng)基有菌生長的常見形式第六十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗：結(jié)果判斷1.陽性對照管應生長良好，陰性對照管應無菌生長2.培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長，如培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，但不能確定是否有微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細菌培養(yǎng)兩天，霉菌培養(yǎng)三天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。第六十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日

釋出物檢查

第七十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗驗證：釋出物檢查目的：對未知或可疑的供試品，在進行無菌試驗實驗前進行方法驗證試驗，以確認供試品在該試驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計。第七十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌實驗驗證：釋出物檢查取滅菌產(chǎn)品以無菌操作轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,30-35℃培養(yǎng)24hrs；

注意：使用與實際無菌實驗同種等量的培養(yǎng)基接種每毫升濃度小于100cfu的菌種稀釋液在無菌培養(yǎng)基內(nèi)，一式兩份，其中一份加入無菌試樣，另一份作為陽性對照，并在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。按表1所列菌種重復以上步驟。第七十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌樣品100cfu菌種＋無菌樣品實驗組對照組釋出物檢查在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。選擇合適的微生物，重復以上步驟。第七十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日釋出物檢查解釋：通過與陽性對照對比，如果在培養(yǎng)容器內(nèi)看不到微生物生長，則說明使用的樣品能抑止細菌或霉菌的生長?？梢钥紤]使用無菌中和劑，如吐溫80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-內(nèi)酰胺酶。如果中和劑無效，增加培養(yǎng)基的量。盡量使用能使試驗微生物生長的最小的培養(yǎng)基的量。第七十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日釋出物檢查常用菌種第七十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日初始污染菌第七十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日定義生物負載：一件產(chǎn)品和/或包裝上存活的微生物總數(shù)。生物負載估計值：通過對活菌計數(shù)或滅菌前活菌計數(shù)加上一個回收效率補償系數(shù)，得出的組成生物負載的微生物數(shù)值。第七十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日初始污染菌相關標準GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學方法第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計ISO-11737-1:2006GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學方法第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計第七十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日樣品份額取樣原則

1定義：樣品份額(SIP)sampleitemportion，即從某一保健產(chǎn)品單元上取出的用于試驗的部分。2取樣注意事項2.1若可操作，試驗應使用整個產(chǎn)品單元。但這往往被認為是不可行的，產(chǎn)品單元上的樣品份額宜在實驗室易于操作的前提下盡可能大。2.2如果所用的樣品份額((SIP)小于一個完整的產(chǎn)品單元，則應選擇代表產(chǎn)品單元的具有微生物的部分。如果已驗證微生物在產(chǎn)品單元上是均勻分布的，應從產(chǎn)品單元上任一部位選擇樣品份額。在缺少這些驗證的情況下，應從產(chǎn)品單元上隨機選擇幾個部分作為樣品份額。2.3樣品份額本身應對產(chǎn)品單元內(nèi)的產(chǎn)品有代表性。當產(chǎn)品分成不同的部分，可以分裝于兩個或多個容器內(nèi)。樣品份額可以根據(jù)供試產(chǎn)品單元的長度、質(zhì)量、體積或表面積。如果產(chǎn)品單元有標簽說明只是液路無菌，宜把液路視為整個試驗單位。(即SIP=1)2.4SIP選擇舉例，見表1第七十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日表1SIP選擇舉例第八十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日表1SIP選擇舉例第八十一頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日

校正因子第八十二頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日校正因子定義：用于對活菌計數(shù)或滅菌前活菌計數(shù)進行修正的數(shù)值，以補償產(chǎn)品上無法完全洗脫的微生物，以便計算出生物負載估計值。第八十三頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日校正因子反復洗脫方法實驗步驟1取樣品1件或sip，投入一定量的無菌洗脫液中(A)。2樣品的處理采用旋渦混臺器(2800次／min)，振蕩2min。3注皿：取處理洗脫液A2ml，分別注入兩個無菌平皿中，每平皿1ml。4再洗脫:將樣品從洗脫液A中取出瀝干，移入另一定量的無菌洗脫液中(B)。5再處理:將B洗脫液置旋渦混臺器(2800次／min)振蕩2min。6再注皿:取B洗脫液2ml，分別注入兩個無菌平皿內(nèi)，每平皿lml。注：當微生物數(shù)少時,從B洗脫液開始，即可用無菌濾膜過濾后直接放培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7如此反復洗脫4次．即A、B、C和D，直至洗脫累積量(初始污染菌)不再增加，最后瀝干樣品，將其平鋪于無菌平皿中(E)。然后將熔化并冷至45～48℃的NA培養(yǎng)基，分別注入A～E各平皿每皿15ml。8待凝固后，放置在規(guī)定的培養(yǎng)條件下(30～35℃，48h～82h)培養(yǎng)，進行活菌計數(shù)。第八十四頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日校正因子=1/0.3825=2.61

校正因子計算第八十五頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日校正因子計算同批產(chǎn)品，需抽取3-5件，進行重復性試驗，確定最小、最大及平均回收率和初始污染菌數(shù)。根據(jù)校正因子，滅菌前初始污染計數(shù)乘以校正因子即為產(chǎn)品帶菌總數(shù)。第八十六頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日初始污染菌方法驗證檢驗洗脫液有無抑菌作用檢驗樣品有無抑菌作用第八十七頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日無菌洗脫液＋初始污染菌樣品＋100cfu菌種1.試驗組3.樣品對照組初始污染菌方法驗證（藥典）在3次獨立的平行試驗中:洗脫液對照組(4)的菌回收率應均不低于70%。（4/2）×100％試驗組(1)的菌回收率應均不低于70%（1-3）/2×100％2.菌液組4.洗脫液對照組100cfu/ml菌種無菌洗脫液＋初始污染菌樣品無菌洗脫液＋100cfu菌種第八十八頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日初始污染菌方法驗證（ISO11737）選用滅菌產(chǎn)品，如果洗脫技術中用到洗脫液，每一產(chǎn)品都應經(jīng)受常規(guī)微生物洗脫技術，則將一定數(shù)量的易受破壞的微生物放人洗脫液中，回收微生物。選用滅菌產(chǎn)品，如果產(chǎn)品直接放人培養(yǎng)基中，可以參照無菌實驗的抑菌實驗進行。第八十九頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日滅菌產(chǎn)品＋100cfu菌種常規(guī)洗脫回收細菌數(shù)100cfu/ml菌種1實驗組2對照組實驗組回收細菌數(shù)/對照組菌數(shù)×100％≥70％初始污染菌方法驗證（ISO11737）第九十頁，共一百頁，編輯于2023年，星期日微生物實驗實驗前實驗中實驗后環(huán)境控制培養(yǎng)基質(zhì)量滅菌控制人員控制無菌操作方法驗證靈敏度實驗無菌檢查無菌實驗初始污染菌B/F驗證洗脫液驗證樣品無抑菌作用儀器校