基因在大腸桿菌酵母中的高效的表達

關于基因在大腸桿菌酵母中的高效的表達第一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日前言基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程?；蚬こ讨饕繕酥皇巧a常規(guī)方法難以生產的大量蛋白質產物—即實現(xiàn)基因的高效表達?；蚋咝П磉_研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產的表達產物。第二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日最佳的基因表達體系：⑴目的基因的表達產量高;⑵表達產物穩(wěn)定;⑶生物活性高;⑷表達產物容易分離純化。第一節(jié)基因的表達系統(tǒng)與表達策略第三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日宿主細胞的選擇一、適合目的基因表達的宿主細胞的要求:1、容易獲得較高濃度的細胞；

2、能利用易得廉價原料；

3、不致病、不產生內毒素；

4、發(fā)熱量低、需氧低、適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；

5、容易進行代謝調控；

6、容易進行DNA重組技術操作；

7、產物的產量、產率高，

8、產物容易提取純化。第四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日二、宿主細胞分為兩大類：1、原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；2、真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。第五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。優(yōu)越性：①對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調控機理已有了深刻了解。②有各類菌株和載體系列。③目前以實現(xiàn)多種基因的高效表達。表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、細胞內可溶性表達、細胞周質表達等。④易培養(yǎng)，成本低。第六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日缺點：①大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，提取困難。②因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表達產物需經變性復性才恢復活性。③蛋白質不能糖基化。產物蛋白質N端多余一個蛋氨酸殘基。④其內毒素很難除去。

第七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產物可糖基化。已有不少真核基因成功表達。第八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日基因表達的基本過程第九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日基因表達的基本過程

基因的表達主要涉及到兩個過程：轉錄和翻譯。首先，目的基因通過轉錄(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；

然后，tRNA（轉運RNA,transferRNA）將各種氨基酸運送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序將各種氨基酸連接成特定的氨基酸序列(translation)最終得到基因的表達產物（蛋白質）。第十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日Transcription(轉錄):

makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.

轉錄的具體過程第十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日

啟動子（promoter）：在基因序列中，標志著轉錄起始的可被RNA聚合酶識別的位點(DNA區(qū)段)，一般位于基因的上游。

終止子（terminator）：位于基因的編碼序列之外（一般在下游）的一段標志著轉錄停止的RNA聚合酶識別位點。有效轉錄的基本條件第十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日正確翻譯的基本條件1、具備起始密碼子2、具備終止密碼子3、具有正確的閱讀框第十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日基因表達的基本過程第十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日根據表達蛋白用途選擇基因的表達策略一、生物化學和分子生物學研究二、表達蛋白質用作抗原三、結構研究第十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日真核基因表達的特點一條成熟的mRNA只能翻譯成一條多肽，不存在象原核生物那樣的多基因操縱子模式；基因轉錄調節(jié)區(qū)很大，而且往往遠離啟動子達幾百個甚至上千個堿基，它們并不直接影響RNA聚合酶與啟動子區(qū)的結合，而是通過改變基因5’上游區(qū)DNA的構型來影響RNA聚合酶與啟動子區(qū)的結合；mRNA合成后穿過核膜進入細胞質中后才進行翻譯工作，而且通常都有復雜的成熟和剪接過程；基因的啟動子區(qū)和原核基因差異很大，而且有增強子序列存在。第十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日原核體系中表達真核基因的困難細菌的RNA聚合酶不識別真核基因的啟動子；真核基因轉錄的mRNA在原核細胞中不能結合到核糖體上；真核基因一般含有內含子，而原核細胞沒有象真核細胞那樣的轉錄后加工系統(tǒng)，所以mRNA中的內含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表達出有功能的真核蛋白；表達的真核蛋白在原核細胞中很不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶降解破壞。第十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日⑴將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核調控體系中。⑵采用真核基因的cDNA序列作為構建表達載體的目的基因，這樣就解決了原核細胞沒有RNA剪接功能的問題。⑶構建載體時，將真核基因插在幾個原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識別和降解，最后可以將融合多肽切除。構建表達載體的策略第十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)克隆基因在大腸桿菌中的表達

R－35－10SD編碼序列OriTcrTT啟動子起始密碼子AUG、GUG、UUG終止密碼子UAAU、UGA、UAG大腸桿菌表達載體的成份

大腸桿菌基因表達系統(tǒng)的表達載體一般是質粒表達載體，含有大腸桿菌內源質粒復制起始位點和有關序列組成的能在大腸桿菌中有效復制的復制子。第十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日大腸桿菌表達載體的成份⑴啟動子要求是：①強啟動子②是誘導性的，如熱誘導和化學誘導。⑵轉錄終止子使轉錄終止，增強mRNA的穩(wěn)定性，提高蛋白質產物的表達水平。尤其是將兩個終止子串聯(lián)，轉錄終止功能更強。⑶核糖體結合位點在轉錄起始位點下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)篩選標記基因

(5)密碼子的選擇第二十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)①T7表達系統(tǒng)T7噬菌RNA聚合酶能選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉錄，其mRNA合成速率相當于大腸桿菌RNA聚合酶的5倍。②Lac表達系統(tǒng)是β-半乳糖苷酶編碼基因LacZ的轉錄的調控序列，該啟動子可以被IPTG誘導，所以在培養(yǎng)基中加入該安慰誘導物就可以誘導目的基因的表達。③Tac表達系統(tǒng)是一種由Lac和Trp啟動子雜合而成的啟動子，其強度得到了很大的提高，也可被IPTG誘導表達。④λPL表達系統(tǒng)是負責λDNA分子轉錄的啟動子之一，是一種極強的啟動子。第二十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日影響克隆基因表達效率的因素

一般而言，所用啟動子的強度、DNA的轉錄起始序列、密碼子的選擇、mRNA的二級結構、轉錄的終止、基因的拷貝數(shù)等都會在一定程度上影響到轉基因的表達。啟動子的結構對表達效率的影響大多數(shù)大腸桿菌啟動子都含有兩種保守區(qū),即-10區(qū)(位于轉錄其始位點上游5-10bp，故稱為-10區(qū)，序列為5’--TATAAT)和-35區(qū)(位于轉錄起始位點上游25bp處，一般有10bp組成，5’--TTGACA故稱為-35區(qū)，)。當然，實際的啟動子中很少具備與上述序列完全一致的區(qū)域，但是研究表明，啟動子的這兩個區(qū)域與上述保守序列的相似程度越高，該啟動子的表達能力也就越強。另外，這兩個保守區(qū)間的距離也是影響啟動子強度的重要因素，即這個間距越是接近于17bp，啟動子的活性就越強。第二十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日b.翻譯起始序列對表達效率的影響

mRNA的有效翻譯依賴于核糖體和其的穩(wěn)定結合，大腸桿菌的mRNA序列中，核糖體的結合位點是起始密碼子AUG和其上游的SD序列。所謂SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一種位于位于起始密碼子上游的一段保守序列，為細菌核糖體有效結合和翻譯起始所必需。一般SD序列的長度約為3-9bp，位于起始密碼子上游3-11堿基的位置，它與16S核糖體RNA的3‘端互補，控制了翻譯的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----

16SrRNA3’末端第二十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日c.啟動子與克隆基因間的距離對基因表達的影響

研究表明啟動子和目的基因間的距離對基因的表達效率影響很大，所以在構建新的表達載體時要考慮到這一因素的影響。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的終止子序列，否則會導致細胞能量的大量消耗，或是形成不應有的二級結構，最終影響的目的基因的表達效率。PromoterSDAUGGeneTerminatorUAAmRNA第二十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日蛋白質的融合表達融合表達一般是將基因引入某表達載體編碼的高表達蛋白（擔體蛋白）序列的3’末端。表達出來的融合蛋白的N末端含有由擔體序列編碼的片段。融合蛋白可以直接用作抗體，但通常是將N端的擔體蛋白部分從C端的目的蛋白中裂解出來，有利于對目的蛋白進行生化研究及功能分析。方法主要有：化學裂解法和酶解法。第二十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日蛋白質的分泌型表達將目的蛋白的基因置于原核蛋白信號肽序列的下游有可能實現(xiàn)分泌表達。實現(xiàn)蛋白質分泌表達有許多有利之處：1.在穿膜過程中信號肽被信號肽酶切除。生產的蛋白質和天然蛋白質是一致的。2.周質中蛋白酶活性低，分泌的蛋白穩(wěn)定。3.周質中細菌的蛋白很少，使得重組蛋白易純化。4.周質中提供了一個氧化環(huán)境，更有利于二硫鍵的正確形成。因此，對于許多難以純化的蛋白質可以通過分泌表達來實現(xiàn)生產。第二十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日蛋白質的包含體形式表達重組蛋白在大腸桿菌中高表達時，絕大多數(shù)是以包含體形式存在的。包含體就是表達的蛋白質在細胞內聚集成沒有生物活性的固體顆粒。不可溶、無生物活性的包含體必需經過變性、復性才能獲得天然結構及生物活性。第二十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日減少包含體形成的策略：1.降低重組菌的生長溫度。2.添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑。如高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖。3.供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH值等。

不過，包含體的形成有時也是有利的，不僅可以獲得高表達、高純度的蛋白質，還可避免細胞水解酶對重組蛋白的破壞。第二十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日有效、理想的復性方法應具備一下幾個特點：1.活性蛋白質的回收率高。2.正確復性的產物易于與錯誤折疊蛋白質分離。3.折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質產品。4.折疊復性方法利用放大。5.復性過程耗時較少。第二十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)基因在酵母中的高效表達大腸桿菌表達系統(tǒng)的缺陷：1.缺失真核生物的蛋白質翻譯后修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等。2.表達的蛋白多以包含體形式存在，需要經過復雜的復性才能恢復構象和生物活性。因此，可以使用真核生物酵母作為表達菌。如釀酒酵母、甲醇酵母等。第三十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期日甲醇酵母表達系統(tǒng)甲醇酵母能利用甲醇為其唯一碳源。