蛋白質(zhì)研究技術(shù)s

所用步驟及數(shù)目取決于純度要求和蛋白的最終用途1當(dāng)前1頁，總共23頁。-透析/超過濾法常用于去除各種鹽類和小分子雜質(zhì)(eg.aftergrade-purifiedbyammoniumsulfate)2當(dāng)前2頁，總共23頁?！?.層析(chromatography)-逆流分溶原理Kd=q(動相)p(靜相)分配系數(shù)：3當(dāng)前3頁，總共23頁。-離子交換層析(電荷狀態(tài))-混合物中不同組分對樹脂中帶電基團(tuán)的親合力將受到溶液pH(決定各組分的電離狀態(tài))和游離鹽離子濃度的影響-對陽離子交換劑親合力低(電負(fù)性更強(qiáng))的組分流經(jīng)層析柱的速度要相對更快一些-與陽離子交換劑結(jié)合得最緊密(電正性最強(qiáng))的組分則可通過采用鹽濃度更高或不同pH的緩沖液將其最后洗脫P(yáng)5-18aAAselutionorderatpH3:acidic(A0)>neutral(A+)>basic(A2+)陽離子交換劑的基質(zhì)為電負(fù)性，可交換陽離子4當(dāng)前4頁，總共23頁。-分子篩/排阻層析(顆粒大小)-親合/吸附層析(配體親和力)5-18b/c5當(dāng)前5頁，總共23頁。§3.電泳(electrophoresis)帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動之現(xiàn)象-電泳介質(zhì)現(xiàn)多采用各種凝膠(eg.瓊脂糖、丙烯酰胺等)-介質(zhì)pH一般維持在堿性區(qū)，使蛋白質(zhì)大多帶負(fù)電荷而向陽極遷移-蛋白質(zhì)的遷移與其質(zhì)量和電荷數(shù)密切相關(guān)6當(dāng)前6頁，總共23頁。-SDS(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)

SDS是陰離子表面活性劑，能破壞氫鍵和疏水互作并與蛋白分子結(jié)合(~1.4gSDS/g

protein)，使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的負(fù)電荷，從而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其分子量的大小分子量在15,000~200,000之間時，蛋白質(zhì)的電泳遷移率與其分子量的對數(shù)值正相關(guān)

7當(dāng)前7頁，總共23頁。-等電聚焦電泳(IFE)利用特定兩性電解質(zhì)構(gòu)建的緩沖液在電場作用下于凝膠內(nèi)沿電場方向建立的pH梯度，使樣品中具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最終均遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處而達(dá)到分離之目的8當(dāng)前8頁，總共23頁。可以將相對分子質(zhì)量相同而等電點不同的蛋白質(zhì)以及等電點相同而相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分開-雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis)

9當(dāng)前9頁，總共23頁?！?.氨基酸序列分析FrederickSanger(1918-)theonlyonewhogotNPforCwice(1958&1980)-各種蛋白質(zhì)均具有其獨特的AA序列，可決定多肽鏈以何種方式折疊、盤繞成獨特的3D構(gòu)象(功能基礎(chǔ))-AA序列異常有可能導(dǎo)致遺傳病

(by1AA>1/3)

eg.sicklecellanemia:

鏈Glu6→Val6-不同物種的相似功能蛋白質(zhì)常具有類似的AA序列

eg.Ser-proteases的催化三聯(lián)體泛蛋白的全部76AA對果蠅和人均完全相同10當(dāng)前10頁，總共23頁。P6-3對酸水解遠(yuǎn)比肽鍵穩(wěn)定短肽可采用自動法測序TFA確定肽鏈的AA組分鑒別肽鏈的N-端殘基(Sangerreagent)鑒別肽鏈的N-端殘基以Edman降解法測定短肽鏈的AA序列PTC基PTH-Aa(~270nmabsop.)DNP-Aa(cf.Fig.2-32)(cf.p42)苯異硫氰PITCPTC基的引進(jìn)只降低1st個肽鍵的穩(wěn)定性

TFA(三氟乙酸)cleavesN-terminalAAbutleavesrestofpolypeptidechainintact11當(dāng)前11頁，總共23頁。氨肽酶法AlaValGly羧肽酶法

-肽鏈末端亦可用酶法測定12當(dāng)前12頁，總共23頁。-Edman法的測定長度取決于每輪循環(huán)降解的有效率以N-末端為Gly-Pro-Lys-的肽鏈為例，如果每輪循環(huán)切除的有效率為97%，則…1stGlyPro-Lys-97%

Gly-Pro-Lys-3%cyclePTH-AAshortenedpeptide2ndPro97%Lys-97%

Gly3%Pro-Lys-2.9%Gly-Pro-Lys-0.1%3rdLys97%

Pro2.9%Gly0.1%目前的降解有效率>99%，可一次性連續(xù)測定出60~70AA序列的肽段PehrEdman1916-197713當(dāng)前13頁，總共23頁。大蛋白需分解成小肽段后再測序-斷開二硫鍵過甲酸氧化/二硫蘇糖醇還原-分割多肽鏈eg.胰蛋白酶+溴化氰-肽段測序Edman降解法-肽段整合比較兩/多套肽段的重疊肽序列-確定二硫鍵部位斷裂二硫鍵前、后的電泳圖譜比較(cf.p43~)在以常規(guī)法確定了完整肽鏈的AA組成(酸水解)和N-末端殘基(DNFB)的基礎(chǔ)上…14當(dāng)前14頁，總共23頁。5-26Cys斷開二硫鍵-過甲酸氧化-二硫蘇糖醇還原

+碘乙酸保護(hù)(cf.p44)磺基丙氨酰(負(fù)電荷增加)15當(dāng)前15頁，總共23頁。t5-7胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶溴化氰(CNBr)(cf.p45)常用的分割肽鏈法分割原則：-斷點少-專性強(qiáng)-反應(yīng)率高肽酰高絲氨酸內(nèi)酯

(cf.Fig.2-30)16當(dāng)前16頁，總共23頁。5-27③兩個Cys僅有一種形成二硫鍵的可能②DNP-Glu(E)-Glu為N-末端殘基④trypsin切割三次生成四個肽段⑤CNBr切割兩次生成三個肽段C-1C-2Similarly…①38AA17當(dāng)前17頁，總共23頁。用互補(bǔ)DNA法推斷蛋白質(zhì)的AA序列待測定蛋白質(zhì)作為抗原抗體合成抗原的多核糖體mRNAcDNA氨基酸序列mRNAProtein分離反轉(zhuǎn)錄測序推斷免疫處理沉淀18當(dāng)前18頁，總共23頁。W1.11多肽液相合成X常用芐氧甲?；鵜常用叔丁酯用PCl5激活參與肽鍵形成的羧基，現(xiàn)在多采用更溫和的疊氮、混合酸酐和活化酯法EmilFischer1852-1919(NPinChemistry,1902)§5.肽的化學(xué)合成19當(dāng)前19頁，總共23頁。羧基掛接氨基去保護(hù)縮合釋放羧基活化保護(hù)氨基P6-13多肽固相合成BruceMerrifield1921-2006二環(huán)己基碳二亞胺(NPinChemistry,1984)H2N1962synthesizedbradykinin(9AA)in27h(ty.85%)20當(dāng)前20頁，總共23頁。Protecta-aminogroupwithFmoc

(9-fluorenylmethoxycarbonylgroup)

LINKAGECANBECLEAVEDBYMILDBASE甲氧羰基芴(二苯并五環(huán))

P6-1221當(dāng)前21頁，總共23頁。t5-8化學(xué)合成肽的主要限制因素之一在于每輪合成的效率-化學(xué)法合成出100AA的肽段需要數(shù)天，而(細(xì)菌)細(xì)胞的生物合成僅需~5min22當(dāng)前22頁，總共23頁。要點提示⑴可以依據(jù)各種蛋白質(zhì)的溶解度、電荷、大小以及結(jié)合特異性上的差異，從生物資源中提取純化蛋白質(zhì)；常用法包括各種層析及電泳技術(shù)⑵柱層析可根據(jù)固相介質(zhì)的不同劃分：凝膠層析按照蛋白質(zhì)