LAMP技術(shù)對豬呼吸道主要病原診斷

LAMP技術(shù)對豬呼吸道主要病原診斷第1頁/共35頁研究意義豬支原體性肺炎是由豬肺炎支原體引起的一種慢性肺炎，還稱作豬地方流行性肺炎，Mare、Switzer和Goodwin等在1965年分別從患肺炎豬的肺組織中分離出其病原，經(jīng)過試驗后成功復(fù)制了本病，將此病原被命名為M.hyopneumoniae。到目前為止，豬支原體性肺炎都被養(yǎng)豬業(yè)人士看做是重要疫病之一，它可能會造成重大經(jīng)濟(jì)損失，發(fā)生頻次較高，而且該病流行最廣，是最難預(yù)防的。本病雖然發(fā)現(xiàn)的很早，但是近年來還是由于經(jīng)常發(fā)生，發(fā)生的方式是與PRRS、圓環(huán)病毒等其它病原引起豬的混合感染，并且對養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

第2頁/共35頁研究意義豬傳染性胸膜肺炎是一種接觸性呼吸道傳染病，是感染豬胸膜肺炎放線桿菌而引起的。主要的臨床特征包括急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎。豬胸膜肺炎放線桿菌Actinobacilluspleuropneumoniae(App)的血清型現(xiàn)在大概有12種，其中有一些毒力較弱且不具有致病性，其他一些則會引起嚴(yán)重的疾病。檢測后毒力很強(qiáng)的是1、5、9、11和12型，而毒力溫和的是3、6型。胸膜肺炎放線桿菌寄生在上呼吸道和扁桃體。病原的傳播途徑主要是通過飛沫或氣霧在短距離內(nèi)傳播，胸膜肺炎放線桿菌在體外只能存活幾天。第3頁/共35頁研究意義豬巴氏桿菌?。╯winepasteurellosis）又被稱作豬肺疫、豬出血性敗血癥，俗稱為“鎖喉風(fēng)”，是一種因感染多殺性巴氏桿菌而引起的傳染病，敗血癥為該病急性型的主要特征，臨床癥狀包括咽喉部出現(xiàn)急性腫脹，病豬呼吸困難；急性型的主要臨床特征是出現(xiàn)纖維素性胸膜肺炎；而慢性型的臨床癥狀并不明顯，一般表現(xiàn)為慢性肺炎、關(guān)節(jié)炎和胃腸炎等，而且病豬逐漸消瘦，國內(nèi)的豬群主要是散發(fā)性的感染。近些年來，我國集約化養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展迅速，進(jìn)而豬群感染巴氏桿菌的報道也逐漸增多。第4頁/共35頁研究意義在黑龍江地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬場，疾病控制一直是十分棘手的問題，特別是豬的呼吸系統(tǒng)疾病呈蔓延擴(kuò)大態(tài)勢，發(fā)病率較高，死亡率在5%～15%或以上，豬的各個日齡階段均存在呼吸道疾病的危害。呼吸系統(tǒng)疾病除直接造成死亡損失外，還因飼料報酬大大降低，繼發(fā)感染等而造成治療費(fèi)用升高，給集約化豬場和養(yǎng)豬戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。把LAMP技術(shù)運(yùn)用對豬病進(jìn)行早期快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查意義重大。同時對規(guī)?；i場的發(fā)病情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，根據(jù)黑龍江省規(guī)?；i場實際制定有效的綜合防病措施，減少因呼吸道疾病給豬場帶來的損失。第5頁/共35頁研究內(nèi)容豬呼吸道疾病的流行病學(xué)調(diào)查豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立LAMP方法的現(xiàn)場應(yīng)用及綜合防治措施的制定第6頁/共35頁豬呼吸道疾病的流行病學(xué)調(diào)查

采集的病例主要來自黑龍江省不同地區(qū)的18個豬場，每個豬場采取了不同的病料數(shù)，并且了解記錄了豬場內(nèi)豬只的發(fā)病情況。第7頁/共35頁豬呼吸道疾病的流行病學(xué)調(diào)查采用血清學(xué)和PCR分子生物學(xué)檢測方法檢測病原菌第8頁/共35頁豬呼吸道疾病流行病學(xué)調(diào)查黑龍江省各地區(qū)豬場豬呼吸道疾病流行病學(xué)調(diào)查柱狀圖第9頁/共35頁豬呼吸道疾病流行病學(xué)調(diào)查經(jīng)過統(tǒng)計，在黑龍江地區(qū)的養(yǎng)豬場，90％的豬場都有豬的呼吸道綜合癥的發(fā)生，在黑龍江屠宰場時有發(fā)現(xiàn)有肺炎病變的豬肺。豬場爆發(fā)豬呼吸道綜合癥后很難清除，它除了造成直接死亡之外，更為嚴(yán)重的是使豬增重緩慢，飼料利用率減少，出欄時間推遲，并長期攜帶多種相關(guān)病原體。有些豬場PRDC的發(fā)病率可達(dá)40%-80%，直接死亡率在20%以上，增重下降或生長停滯的可達(dá)70%，有的豬場甚至被迫將該階段的豬全部淘汰。很多呼吸道綜合癥的病原體所引發(fā)的臨床癥狀極為相似，很難通過臨床癥狀做出正確的診斷。有些疾?。ㄈ缲i藍(lán)耳病）已經(jīng)不能表現(xiàn)出其臨床的特異性癥狀，有些病原體還有相當(dāng)長的潛伏期。因此更加難以做出準(zhǔn)確的診斷。血清學(xué)診斷雖然能在一定程度上做出確診，但時間較長，難以滿足現(xiàn)場需要。因此，研究出能夠同時對多種病原進(jìn)行診斷的方法勢在必行。同時對規(guī)模化豬場的發(fā)病情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，根據(jù)黑龍江省規(guī)?；i場實際制定有效的綜合防病措施，減少因呼吸道疾病給豬場帶來的損失。第10頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立引物設(shè)計與合成豬支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬巴氏桿菌基因組的提取

LAMP

診斷方法反應(yīng)條件的優(yōu)化實驗方法PCR擴(kuò)增及鑒定第11頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果pMD18-T-Mh載體PCR鑒定結(jié)果1-2：擴(kuò)增Mh基因；3-4：擴(kuò)增App基因；5：擴(kuò)增Sp基因；6：陽性對照；7：陰性對照1-5:ThePCRidentificationresultofthepMD18-T-Mh、pMD18-T-App、pMD18-T-Spplasmid6:Thepositivecontrol;7:ThenegativecontrolM12345672000bp1000bp750bp500bp250bp100bp第12頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立LAMP檢測方法反應(yīng)條件的優(yōu)化豬肺炎支原體內(nèi)外引物的優(yōu)化外引物不同濃度下電泳結(jié)果1-4的濃度：0.1pmol/μL、0.15pmol/μL、0.2pmol/μL、0.25pmol/μL；5：陽性對照6：陰性對照2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM123456M123456內(nèi)引物不同濃度下電泳結(jié)果1-4的濃度：0.4pmol/μL、0.5pmol/μL、0.6pmol/μL、0.7pmol/μL；5：陽性對照6：陰性對照第13頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立豬放線桿菌內(nèi)外引物的優(yōu)化外引物不同濃度下電泳結(jié)果1-5的濃度：0.1pmol/μL、0.15pmol/μL、0.2pmol/μL、0.25pmol/μL；5：0.3pmol/μL；6：陽性對照2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234562000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12345內(nèi)引物不同濃度下電泳結(jié)果1-4的濃度：0.4pmol/μL、0.5pmol/μL、0.6pmol/μL、0.7pmol/μL；5：陽性對照第14頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立豬巴氏桿菌內(nèi)外引物的優(yōu)化外引物不同濃度下電泳結(jié)果1-4的濃度：0.1pmol/μL、0.15pmol/μL、0.2pmol/μL、0.25pmol/μL；5：陰性對照2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12345內(nèi)引物不同濃度下電泳結(jié)果1-3的濃度：0.4pmol/μL、0.5pmol/μL、0.6pmol/μL；4：陰性對照2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234第15頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立dNTP+濃度的濃度的優(yōu)化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234567dNTP+不同濃度下電泳結(jié)果1-4的濃度：0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L；

5：陽性對照；6-7：陰性對照第16頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立BstDNA聚合酶用量的優(yōu)化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234567M不同BstDNA聚合酶下電泳結(jié)果1-5的體積：3U、4.8U、6.4U、8U、9.6U；6：陽性對照；7：陰性對照第17頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立MgSO4

濃度的優(yōu)化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMgSO4不同濃度下電泳結(jié)果1-5的濃度：2.5mmol/L、3.75mmol/L、5mmol/L、6.25mmol/L、7.5mmol/L;2.10：陽性對照；7：陰性對照M1234567第18頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立優(yōu)化后建立LAMP檢測方法組成體系（μL）外引物（支F3、支R3）（10pmol/μL）內(nèi)引物（支F1/F2、支R1/R2）（10pmol/μL）dNTP＋（10mmol/L）MgSO4（25mmol/L）10×LAMP反應(yīng)緩沖液BstDNA聚合酶（8U/μL）模板DNAddH2O合計0.41.01.03.02.01.01.010.620.0LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系第19頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立豬支原體肺炎特異性檢測2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM123456789M特異性檢驗電泳結(jié)果1：陽性對照；2：支原體肺炎；3-8：多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌和鏈球菌；9：陰性對照第20頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立多殺性巴氏桿菌特異性檢測2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234M特異性檢驗電泳結(jié)果1：肺炎雙球菌；2：副豬嗜血桿菌；3：多殺性巴氏桿菌4：陰性對照第21頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立豬胸膜肺炎放線桿菌特異性檢測2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234特異性檢驗電泳結(jié)果1：陰性對照；2：肺炎雙球菌3：副豬嗜血桿菌；4：豬胸膜肺炎放線桿菌第22頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立敏感性檢驗結(jié)果2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM123456M不同模板濃度下電泳結(jié)果1-5的濃度：10-5、10-4、10-3、10-2、10-1；6：10-6第23頁/共35頁豬呼吸道疾病的主要病原檢測LAMP方法的建立

試驗中以支原體肺炎、多殺性巴氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌基因組為模板，通過對內(nèi)外引物的比例、dNTP+濃度、Mg2+

濃度和BstDNA聚合酶用量等條件逐一優(yōu)化。在1.2％的瓊脂糖電泳結(jié)果表明：其內(nèi)、外引物的體積分別為1.0μL、0.4μL，其dNTP+的體積為1.0μL，其BstDNA聚合酶的體積為1μL，MgSO4

的體積為3μL，整個試驗僅需約1h左右，比一些常規(guī)的方法時間上要短，在這個條件下能夠得到較為特異的目的梯狀條帶，與常規(guī)PCR反應(yīng)相比，大大縮短了檢測時間。并且LAMP的反應(yīng)結(jié)果是一種梯狀的條帶，與肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌和鏈球菌相比，LAMP分析結(jié)果能夠特異性的鑒別豬肺炎支原體，該方法表現(xiàn)出了很高的可靠性，且操作簡單。LAMP方法檢測多殺性巴氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌比常規(guī)方法檢測及血清學(xué)檢測時間要縮短很多，而且明顯增加了檢測的敏感性和準(zhǔn)確性。從結(jié)果中表明可以成功建立了肺炎支原體、放線桿菌和巴氏桿菌的LAMP診斷方法，為我們國家臨床上診斷支原體肺炎、放線桿菌和巴氏桿菌提供了靈敏有效的分子生物學(xué)的方法。第24頁/共35頁LAMP方法的現(xiàn)場應(yīng)用及綜合防治措施的制定豬肺炎支原體的防制措施：（l）做好豬場環(huán)境衛(wèi)生工作：定期對豬場內(nèi)進(jìn)行衛(wèi)生清掃和消毒工作。采取自繁自養(yǎng)的原則，避免引進(jìn)種豬或仔豬時從外地或其他豬場引進(jìn)，特別是購豬的車輛進(jìn)入廠區(qū)必須經(jīng)過嚴(yán)格消毒才能進(jìn)入。（2）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：嚴(yán)格注意豬舍內(nèi)部的溫度，預(yù)防突發(fā)情況，注意豬舍內(nèi)通風(fēng)順暢，時刻保持豬舍空氣新鮮。冬季每天查看豬舍是否有漏風(fēng)，夏季注意降低豬舍內(nèi)的溫度。做到合理的飼養(yǎng)密度：保育舍2—3頭/m2；育肥舍0.8頭/m2；一個飼養(yǎng)小組應(yīng)該在10—13頭豬。飼養(yǎng)使用全價飼料，這樣可以提高豬的抵抗力，同時定期進(jìn)行驅(qū)蟲。（3）做好疫苗預(yù)防：在仔豬出生7—21天，注射支原體活苗，通過免疫接種有效地預(yù)防和控制支原體肺炎。這樣對預(yù)防支原體肺炎具有顯著效果。（4）藥物控制：定期在飼料中添加某些藥物是預(yù)防支原體肺炎的重要手段。藥物有：土霉素、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)脂類、替米考星、林克霉素、泰妙菌素、氟苯尼考、恩諾沙星、泰樂菌素、強(qiáng)力霉素等對支原體都有較好的預(yù)防效果。第25頁/共35頁LAMP方法的現(xiàn)場應(yīng)用及綜合防治措施的制定豬巴氏桿菌病的防制（1）對于本病的預(yù)防要制定合理的免疫程序，及時預(yù)防接種。目前主要使用豬繁殖與呼吸綜合癥滅活疫苗和豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯(lián)苗進(jìn)行接種。藍(lán)耳病疫苗在仔豬45日齡進(jìn)行首免，每頭肌肉注射2毫升。首免后一個月可用相同劑量的疫苗加強(qiáng)免疫一次，后備母豬在70日齡前同仔豬一樣免疫。懷孕母豬在分娩前一個月加強(qiáng)免疫一次，劑量為每頭4毫升。種公豬在70日齡前接種同仔豬一樣免疫，以后每隔6個月免疫一次，劑量為每頭4毫升。要注意的是已經(jīng)發(fā)病的豬和屠宰前21天的豬不宜接種。豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯(lián)苗在接種藍(lán)耳病疫苗后7天給予接種。苗豬在閹割時接種，每頭1毫升，轉(zhuǎn)群或出售時再用同樣劑量免疫一次。公豬每隔6個月免疫一次，每頭3毫升。母豬在苗豬閹割時接種，每頭3毫升。（2）對混合感染的病例，建議聯(lián)合使用抗菌和抗病毒藥物。可用青霉素、鏈霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、頭孢類藥、環(huán)丙沙星、氟苯尼考等藥物交替使用。對體溫升高的重癥病例，在使用抗生素的同時，可在飲水中加入適量的多種維生素、葡萄糖、氯化鉀、鈉等補(bǔ)液，以維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。有條件的豬場可用干擾素、高免血清、免疫球蛋白等藥物進(jìn)行特異性治療。也可用中藥方劑清熱敗毒散，拌料飼喂，有一定療效。第26頁/共35頁LAMP方法的現(xiàn)場應(yīng)用及綜合防治措施的制定豬傳染性胸膜肺炎控制措施：（1）注意保持環(huán)境衛(wèi)生：環(huán)境的變化等應(yīng)激刺激可能會促進(jìn)該病的發(fā)生，因此要減少或避免各種應(yīng)激因素的影響，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持為豬群提供足夠均衡的營養(yǎng)。注意保持飼養(yǎng)舍內(nèi)通風(fēng)良好，空氣清新，及時清除糞便和垃圾，減少塵埃和氨的含量。（2）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：如果條件允許應(yīng)該采用全進(jìn)全出的飼養(yǎng)方式，即在豬出欄后對圈舍進(jìn)行徹底的清潔和消毒1周后才能再次使用。（3）當(dāng)引進(jìn)的公豬和后備母豬時應(yīng)該確保沒有感染過APP，或者引進(jìn)的豬接種過3次多價APP疫苗。而且接種的APP疫苗項目應(yīng)該包括主要流行菌株和本場分離株的滅活疫苗。（4）如果爆發(fā)嚴(yán)重，應(yīng)該制定用藥規(guī)劃。如在混群或進(jìn)行其它操作處理前1～2d，應(yīng)該給與豬群一些敏感、廣譜的抗菌藥物；也可以連續(xù)5d在飼料中添加0.04%SM2+TMP。發(fā)現(xiàn)有該病發(fā)生的養(yǎng)殖場可以根據(jù)根據(jù)實際情況，在發(fā)病豬群飼料中適當(dāng)增加添加抗生素的劑量，如連續(xù)3～5d在飼料中添加土霉素600g/t，或連續(xù)5～7d添加(林肯霉素+壯觀霉素)500～1000g/t，可防止新的病例出現(xiàn)。（5）加強(qiáng)養(yǎng)殖場疾病預(yù)防，可以通過剖檢和病原分離的方法確定本病是否在本養(yǎng)殖場內(nèi)存在，一旦發(fā)現(xiàn)患病豬，應(yīng)該立即隔離飼養(yǎng)。如果發(fā)現(xiàn)病豬，應(yīng)該及時進(jìn)行治療，注射青霉素、新霉素、泰樂菌素、四環(huán)素等療效較為顯著。感染本病較嚴(yán)重的豬場可用血清學(xué)方法檢查，逐步清除帶菌豬。并在飼料中添加藥物進(jìn)行防治，建立健康豬群。第27頁/共35頁LAMP方法的現(xiàn)場應(yīng)用病料編號來源時間發(fā)病情況病料數(shù)陽性結(jié)果1-3樺川縣豬場2011.0940日齡左右保育豬咳喘、消瘦334-9樺川縣豬場2011.0960日齡保育豬咳喘、貧血、死亡9810-12肇東豬場2011.0925日齡咳嗽、消瘦、衰竭死亡3313-19樺川縣豬場2011.1035日齡咳嗽、消瘦、衰竭死亡7520肇東豬場2011.10育肥豬咳嗽、喘、死亡1121-26香坊豬場2011.1050日齡左右群體性咳喘、死亡率高6527-30肇源豬場2011.1030日齡左右突然咳喘、發(fā)燒、厭食4331呼蘭豬場2011.1080日齡生長豬腹式呼吸、用藥無效1132-33呼蘭豬場2011.10外購仔豬，群體咳喘、呼吸困難用藥無效2134-38安達(dá)豬場2011.11斷奶仔豬消瘦、貧血、治療無效5539-42肇東豬場2011.11外購仔豬，群體咳喘、呼吸困難用藥無效4243-45大慶豬場2011.11120日齡育成豬、咳喘、治療效果差3246-48雙城豬場2011.1245日齡保育豬突然死亡、其他咳喘3349-50平房豬場2011.1260日齡保育豬咳喘、貧血、死亡2251-53肇東豬場2011.1260日齡保育豬咳喘、貧血、死亡3354-58賓縣豬場2012.0160-80日齡豬，頑固性咳喘、治療效果差5359-60肇源豬場2012.01育肥豬慢性消瘦、治療效果差、死亡2261-63呼蘭豬場2012.01外購仔豬，突然群體發(fā)病，呼吸困難3264雙城豬場2012.01保育40多日齡突然死亡10合計6454陽性率84.38%LAMP檢測肺炎支原體陽性結(jié)果第28頁/共35頁LAMP方法的現(xiàn)場應(yīng)用來源時間發(fā)病情況病料數(shù)陽性結(jié)果肇東豬場2011.0925日齡咳嗽、消瘦、衰竭死亡22樺川縣豬場2011.135日齡咳嗽、消瘦、衰竭死亡54肇東豬場2011.1育肥豬咳嗽、喘、死亡22香坊豬場2011.150日齡左右群體性咳喘、死亡率高11肇源豬場2011.130日齡左右突然咳喘、發(fā)燒、厭食11呼蘭豬場2011.1外購仔豬，群體咳喘、呼吸困難用藥無效21安達(dá)豬場2011.11斷奶仔豬消瘦、貧血、治療無效32大慶豬場2011.11120日齡育成豬、咳喘、治療效果差33雙城豬場2011.1245日齡保育豬突然死亡、其他咳喘43平房豬場2011.1260日齡保育豬咳喘、貧血、死亡11肇東豬場2011.1260日齡保育豬咳喘、貧血、死亡11賓縣豬場2012.0160-80日齡豬，頑固性咳喘、治療效果差33肇源豬場2012.01育肥豬慢性消瘦、治療效果差、死亡10呼蘭豬場2012.01外購仔豬，突然群體發(fā)病，呼吸困難22雙城豬場2012.01保育40多日齡突然死亡11合計

3227陽性率

84.38%LAMP檢測巴氏桿菌陽性結(jié)果第29頁/共35頁LAMP方法的現(xiàn)場應(yīng)用LAMP檢測胸膜肺炎放線桿菌陽性結(jié)果來源時間發(fā)病情況病料數(shù)陽性結(jié)果肇東豬場2011.0925日齡咳嗽、消瘦、衰竭死亡11樺川縣豬場2011.135日齡咳嗽、消瘦、衰竭死亡22肇東豬場2011.1育肥豬咳嗽、喘、死亡10香坊豬場2011.150日齡左右群體性咳喘、死亡率高54肇源豬場2011.130日齡左右突然咳喘、發(fā)燒、厭食32呼蘭豬場2011.1外購仔豬，群體咳喘、呼吸困難用藥無效11安達(dá)豬場2011.11斷奶仔豬消瘦、貧血、治療無效44大慶豬場2011.11120日齡育成豬、咳喘、治療效果差33雙城豬場2011.1245日齡保育豬突然死亡、其他咳喘10平房豬場2011.1260日齡保育豬咳喘、貧血、死亡11肇東豬場2011.1260日齡保育豬咳喘、貧血、死亡54