基因表達沉默技術

基因表達沉默技術第一頁，共六十二頁，2022年，8月28日1教學內容及要求1234反義核酸技術核酶技術基因敲除技術RNA干擾技術重點熟悉第二頁，共六十二頁，2022年，8月28日2參考資料《基因工程及其分子生物學基礎-基因工程分冊》，北京大學出版社，靜國忠編自備材料（個人實踐經(jīng)驗）第三頁，共六十二頁，2022年，8月28日3第一節(jié)RNA干擾技術第四頁，共六十二頁，2022年，8月28日4基本概念掌握RNA干擾(RNAinterference,RNAi):由小雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。小干擾RNA:具有干擾功能的這種短雙鏈RNA就稱為小干擾RNA（SmallinterferingRNA,siRNA)。第五頁，共六十二頁，2022年，8月28日5注射sense秀麗線蟲antisense注射1995年．．．．．．發(fā)現(xiàn)歷史第六頁，共六十二頁，2022年，8月28日6反義RNA(antisenseRNA)對基因抑制效應比較微弱；而雙鏈RNA（dsRNA）能夠高效特異性阻斷靶基因的表達。

animportantfinding?。?998年第七頁，共六十二頁，2022年，8月28日7

CraigC.Mello

克雷格·梅洛AndrewZ.Fire安德魯·菲爾2006NobelPrizeinPhysiologyorMedicine第八頁，共六十二頁，2022年，8月28日8隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi也存在于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。RNAi現(xiàn)象的普遍性第九頁，共六十二頁，2022年，8月28日9靶RNAi機制siRNA在ATP參與下形成RISC復合體，被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中的反義鏈指導移至靶mRNA，靶mRNA被切割后誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。外源長dsRNA在ATP作用下被RNaseⅢDicer切割成21nt左右、由正義和反義鏈組成的siRNA重點第十頁，共六十二頁，2022年，8月28日10siRNA19bpduplex2nt3’overhangs21ntsiRNA實驗設計難點第十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日111）靶序列的調出NationalCenterfor

BiotechnologyInformation

第十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日12第十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日13第十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日142）利用免費設計軟件進行siRNA設計InvitrogenTakaraOligoegine

第十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日15軟件的選擇原則1、選擇可讀框內、翻譯起始位點之后50～100nt的序列作為靶序列；2、選擇的靶位5’端之前的兩個堿基為AA；3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；4、堿基數(shù)目控制在19～21nt；5、避免連續(xù)3個或3個以上的相同堿基；6、避免重復序列或回文結構以免形成發(fā)夾狀結構；7、靶序列同數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對。第十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日16我用的軟件：siDirect第十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日173）siRNA合成或表達RNA聚合酶Ⅲ啟動子（包括U6或H1）：轉錄起始點明確；轉錄生成小RNA；轉錄產(chǎn)物無polyA尾；轉錄終止為5個連續(xù)的U。第十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日18第十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日19第二十頁，共六十二頁，2022年，8月28日20第二十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日213mg/ml正向引物1μl3mg/ml反向引物1μl90°C4min70°C10min室溫訂購合成的引物序列退火第二十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日224)siRNAworking?第二十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日23mRNA:Real-timePCRProtein:Westernblot17siRNAMock第二十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日245)合成or構建載體？化學合成siRNA：

瞬時轉染實驗花費高使用的時候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理過的滅菌蒸餾水溶解，這是因為siRNA易被RNA酶降解。B.載體：為了長期觀察基因沉默后的影響，需要長期表達siRNA。C.載體選擇：易轉染的細胞用質粒載體，難轉染的細胞用逆轉錄載體或慢病毒載體。第二十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日256）體外導入細胞a.脂質體轉染：＋＋＋＋＋－－－－－－＋具體操作步驟：按照脂質體說明書進行第二十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日26b.電穿孔導入：第二十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日27c.病毒感染（以腺病毒為例）：第二十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日28next第二十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日29第二節(jié)反義核酸技術第三十頁，共六十二頁，2022年，8月28日301978年，Stephenson和Zamecnik首次報道了反義寡脫氧核苷酸可抑制勞斯肉瘤病毒RSV的復制現(xiàn)象。1984年，Izantweintraub提出了“反義核酸技術”的概念。InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide.ProcNatlAcadSciUSA,1978;75:285-288.歷史由來第三十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日31反義寡核苷酸概念：正義鏈互補的一段核苷酸序列，包括反義DNA和反義RNA?；靖拍罘戳xRNA技術反義DNA技術第三十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日32反義抑制的主要機理直接作用于靶mRNA的SD序列或部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶H降解。反義核酸mRNARNaseH第三十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日33論著超過１６０００篇?；蚬δ苎芯浚?994年流行）

如抗病毒或抗腫瘤基因治療研究等領域。反義核酸應用第三十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日341998年8月27日，美國食品藥品管理局（FDA）正式批準了由ISIS公司開發(fā)的全球第一個反義藥物“Vitravene”（福米韋生，fomivirsen）在美國上市。該藥抗病毒作用較強，是更昔洛韋的1000倍，用于治療巨細胞病毒性視網(wǎng)膜炎和艾滋病人并發(fā)巨細胞視網(wǎng)膜炎,有效率高達80%-90%。Vitravene為注射劑，患者每月只需注射一次藥物（利用專用針頭直接注射進眼球內），不良反應有虹膜炎、玻璃體炎，發(fā)生率為25％，用糖皮質激素治療可緩解或消除其炎性反應。2１個硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸組成５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇

第三十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日35a.避免內源性核酸酶對其降解b.提高自身穩(wěn)定性以及與靶分子的親和力Hdeoxyribose提高有效性技術難點修飾第三十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日36第一代硫代修飾（Phosphorothioate）ResistingToNucleases；ActivatingRNaseHpathwaysO第三十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日37第二代修飾(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl)ResistingToNucleases；notactivatingRNaseHpathways第三十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日382001主要用于治療老年人中十分常見的視網(wǎng)膜黃斑退化癥

Macugen哌加他尼第三十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日39

2003新一代抗HIV新藥，屬于病毒的融合阻止劑類藥物

Fuzeon

20570$第四十頁，共六十二頁，2022年，8月28日40Tysabri2004專治多發(fā)性硬化癥

第四十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日41next第四十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日42第三節(jié)核酶技術第四十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日43核酶（ribozyme）ribonucleicacidenzyme具有催化活性的RNA，化學本質是RNA,卻具有酶的催化功能。基本概念第四十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日44切赫(T.R.Cech)（1947-），美國人,他獨立地發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)四膜蟲轉錄產(chǎn)物rRNA前體，可切除自身的413個核苷酸的內含子，使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。歷史由來ThomasR.Cech1982

第四十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日45S.Altman研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RNaseP的蛋白質部分除去后，留下RNA能夠切割rRNA前體的5’端。1983

第四十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日461989NobelPrizeinChemistry核酶的發(fā)現(xiàn)改變了“所有酶都是蛋白質”的傳統(tǒng)觀念第四十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日47

有封閉切割RNA應用——阻斷基因的表達（1994年左右比較流行的研究工具）第四十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日48通常由60個核苷酸左右組成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13個堿基。錘頭狀核酶結構示意圖第四十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日49next第五十頁，共六十二頁，2022年，8月28日50第四節(jié)基因敲除技術時間：80年代末功能：建立基因失活或缺失的動物模型第五十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日51發(fā)展歷史a.胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）分離培養(yǎng)取自小鼠受精卵發(fā)育第4，5天的胚胎細胞能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性

1981年，馬丁·埃文斯(MartinJ．Evans)從正常的小鼠囊胚中分離到了ES細胞。小鼠ES細胞的分離和應用是ES細胞技術發(fā)展的里程碑。第五十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日52同源重組：是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中相同或者相似DNA序列間的重組，通常通過一對同源分子非姊妹染色體間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片段。b.同源重組技術應用第五十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日531985年，奧利弗·史密塞斯(OliverSmithies)等首次報道在腫瘤細胞中實現(xiàn)了人工打靶載體和內源β-球蛋白基因間的同源重組。第五十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日541988年，卡佩基安德等發(fā)展了一種稱為“正負篩選”的策略，將胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打靶載體的外側，作為篩選的負性標記。這比單用陽性篩選正確克隆富集的倍數(shù)高3~10倍，真正使得同源重組技術得以應用。馬里奧·卡佩基安德(MarioR．Capechiand)丙氧鳥苷第五十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日55MartinEvans馬丁·埃文斯MarioCapecchi馬里奧·卡佩基OliverSmithies奧利弗·史密斯第五十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日56原理和操