基因操作中大分子的分離和分析級

基因操作中大分子的分離和分析級第1頁/共30頁1、DNA的組成和結(jié)構(gòu)Watson---美國生物學家,曾獲1962年諾貝爾生理學-醫(yī)學獎

Crick---英國生物物理學家,曾獲1962年諾貝爾生理學-醫(yī)學獎1953年Watson和Crick建立了DNA分子的雙螺旋模型.發(fā)表在《Nature》第2頁/共29頁第2頁/共30頁BAZ計算機模擬DNA構(gòu)型第3頁/共29頁第3頁/共30頁formconditionBaseturnRatpairHeightpairdiameterBrh92~95低Na+1036°3.38?19?Arh75,高Na+RNA-DNA1132.7°2.56?23?Z富含G-C高K+1230°3.71?18?幾種DNA構(gòu)型比較第4頁/共29頁第4頁/共30頁DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型第5頁/共29頁第5頁/共30頁變性(denaturation）:指在溫度、pH等因素作用下，DNA分子的氫鍵受到破壞，雙鏈分開的過程。復性（renaturation)：是變性的逆過程，DNA互補配對成為雙鏈的過程。帶電性：一般pH下，帶負電荷，可電泳分離。水溶解性：DNA分子外形成水膜，可溶于水；但當電荷變化（如等電點）或水膜破壞時，就會沉淀，這是提取和分離DNA的依據(jù)。2、DNA分子的重要特性第6頁/共29頁第6頁/共30頁3、染色體DNA的分離和純化真核、原核生物均有，103~106kb用于分離目的基因或基因表達調(diào)控因子（啟動子（promoter））提供構(gòu)建染色體載體和染色體基因整合平臺第7頁/共29頁第7頁/共30頁材料準備：

使材料處于提取DNA得率最高的時期，選取最容易提取和含量最高的組織。大腸桿菌：菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期植物：幼嫩的植株或黃化幼苗動物：肝臟應清除凈膽囊第8頁/共29頁第8頁/共30頁細胞裂解：關(guān)系到能否提取到DNA以及影響DNA得率高低和質(zhì)量的關(guān)鍵步驟

細胞裂解緩沖液

100mmol/LTris-HCl,pH8.0100mmol/LEDTA250mmol/LNaCl

防止和抑制內(nèi)源DNase對DNA的降解

第9頁/共29頁第9頁/共30頁分離和抽提DNA：根據(jù)待提取的DNA的性質(zhì)，使其與細胞內(nèi)的其他組分分離。提取總DNA只須在細胞裂解液中加入適當?shù)姆?氯仿/異戊醇(25:24:1)或氯仿/異戊醇(24:1)等有機溶液，可使DNA與蛋白質(zhì)分開。用乙醇或異丙醇處理含DNA的水相，使其沉淀，離心獲得DNA第10頁/共29頁第10頁/共30頁4、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化

提純質(zhì)粒DNA的三個步驟：培養(yǎng)細菌：對數(shù)生長期的細菌。收集和裂解細菌：通過離心法收獲細菌。

細菌的裂解方法有：非離子型或離子型去污劑、有機溶劑、堿變性以及加熱處理等。純化質(zhì)粒DNA

瓊脂糖凝膠電泳、CsCl-溴化乙錠梯度平衡離心法等第11頁/共29頁第11頁/共30頁堿裂解法提取E.coli質(zhì)粒DNA的原理

由Birnboim和Doly設計并于1979年發(fā)表。

在堿性條件下(pH12.0~12.5)線狀DNA發(fā)生變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀。在高鹽條件下作復性處理，變性的染色體DNA會形成沉淀，從而將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開。第12頁/共29頁第12頁/共30頁抽提/裂解緩沖液

溶液Ⅰ：滅菌后，4℃保存

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris-Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅱ：現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫下使用(pH12.0~12.5)0.2mol/LNaOH1%SDS

溶液Ⅲ：滅菌后，4℃保存，用時冰浴(pH4.6)5mol/L乙酸鉀60ml

冰醋酸11.5ml

水28.5ml

溶液Ⅰ∶溶液Ⅱ∶溶液Ⅲ=1∶2∶1.5第13頁/共29頁第13頁/共30頁質(zhì)粒DNA的純化用苯酚/氯仿抽提去蛋白質(zhì)雜質(zhì)

一般先按1:1（V:V）用苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)對DNA粗制品進行抽提，然后用1:1（V:V）氯仿/異戊醇(24:1)再次抽提，以除去蛋白質(zhì)用無水乙醇沉淀濃縮DNA

按2:1用無水乙醇（V:V）或1:1用異丙醇（V:V）在酸性條件下（加1/10體積的3MNaAcpH5.2）沉淀DNA。

用RNase去除RNA

第14頁/共29頁第14頁/共30頁4、DNA的凝膠電泳

一定電場中，DNA分子的遷移率與所含堿基對數(shù)成反比。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖（agarose,線性多糖聚合物）凝膠緩沖液和電泳緩沖液(TBE,pH8.3)：

45mmol/LTris-硼酸

1mmol/LEDTA

聚丙烯酰胺凝膠電泳

30%丙烯酰胺第15頁/共29頁第15頁/共30頁Bio-Rab電泳儀電源水平電泳槽和一些梳子DNA泳動方向第16頁/共29頁第16頁/共30頁溴化乙錠(EB)能摻入到雙鏈DNA中，在紫外光下會發(fā)出橙紅色的熒光。使用濃度：0.5μg/ml紫外線波長：

254nm

302nm366nmDNA泳動方向是從負極向正極.一般使用的電壓為5V/cm.第17頁/共29頁第17頁/共30頁瓊脂糖凝膠Marker---DNA分子標尺DNA點樣孔1000bp2500bp5000bp15000bp1000bp8000bp線性DNA分子開環(huán)DNA分子第18頁/共29頁第18頁/共30頁影響DNA樣品在電泳時泳動速率的因素與DNA分子量對數(shù)成反比

DNA的構(gòu)象：超螺旋＞線性＞開環(huán)形SC構(gòu)型：共價閉合環(huán)形DNA(cccDNA)OC構(gòu)型：開環(huán)DNA(ocDNA)L構(gòu)型：線性分子DNA(LDNA)

與電流大小成正比遷移率與凝膠濃度成反比第19頁/共29頁第19頁/共30頁二、RNA的分離、檢測和純化

1、RNA的組成與結(jié)構(gòu)特性2、RNA的抽提和純化3、mRNA的純化4、RNA的檢測5、RNA的電泳檢測第20頁/共29頁第20頁/共30頁1、RNA的組成與結(jié)構(gòu)特性mRNA:1~5%rRNA:80~85%(28S、18S和5S)tRNA/microRNA:15~20%第21頁/共29頁第21頁/共30頁2、RNA的抽提和純化溶液和用具的去RNA酶處理

RNA酶非常耐高溫，即使高溫滅菌也不可完全清除其活性。耐熱的物品：高溫干熱滅菌效果最好。微量移液吸頭和離心管：0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過的水浸泡后在高溫滅菌。電泳用具：專用！用3%H2O2和0.1%DEPC水浸泡，清洗干凈。第22頁/共29頁第22頁/共30頁酚-異硫氰酸胍抽提法（TRIZOL試劑）

在液氮中研磨組織或細胞，加入TRIZOL試劑，加入氯仿抽提，離心，水相和有機相分離；收集含RNA的水相；通過異丙醇沉淀，可獲得RNA樣品。含有的少量DNA可使用無RNA酶的DNaseI處理去除痕量的DNA.第23頁/共29頁第23頁/共30頁3、mRNA的純化

真核生物mRNA的3′端有一個poly(A)尾，可用親和層析的方法純化。

(oligo(dT)-纖維素)

作用：構(gòu)建真核生物的cDNA文庫。第24頁/共29頁第24頁/共30頁第25頁/共29頁第25頁/共30頁4、RNA的檢測

核酸蛋白檢測儀來分析紫外光260nm時的OD値來判斷：RNA的濃度：

OD260=1RNA濃度為40μg/mlRNA的純度：

OD260/OD280=1.8~2.0為最好；當比值小于1.8時，說明有蛋白質(zhì)雜質(zhì)；當比值大于2.0時，所提RNA部分降解。第26頁/共29頁第26頁/共30頁5、RNA的電泳檢測通過瓊脂糖電泳進行RNA分析是在變性的條件下進行的。原因：RNA呈單鏈狀態(tài)，易形成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)。常用的變性劑：甲醛第27頁/共29頁第27頁/共30頁復習內(nèi)容（P100~107）本章所講的知識點在隨后的實驗課中均會涉及，希望同學們課后認真復習！

1、試驗中所使用各種試劑的作用

2、從核酸中如何去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)